烟台地区3785例新生儿遗传性耳聋基因位点筛查分析
2022-09-22张彦红高凌云李颖斌马莉刘日明
张彦红 高凌云 李颖斌 马莉 刘日明
耳聋是我国常见的出生缺陷之一,给患者带来了巨大的痛苦和生活不便。我国耳聋在新生儿中的发病率为1‰~3.47‰,遗传因素致聋比例高达50%~60%[1]。目前,遗传性耳聋相关基因很多,我国人群中耳聋基因的突变70%来源于GJB2、GJB3、SLC26A4和mt DNA 12S rRNA[2~6]。为了解烟台地区新生儿耳聋基因的突变情况,本研究采用微阵列基因芯片方法筛查,并联合Sanger测序进行验证,探讨耳聋基因筛查在预防新生儿遗传性耳聋发生的意义。
1 资料与方法
1.1 研究对象
选取2017年11月1日~2021年6月30日烟台毓璜顶医院正常分娩的3785例新生儿作为研究对象,该研究经院伦理委员会批准,监护人接受新生儿遗传性耳聋基因检测,并签署知情同意书。按照《新生儿疾病筛查技术规范(2010 版)》和采血常规要求[7],采取新生儿足跟血制备滤纸干血斑,4 ℃保存备用。
1.2 仪器与试剂
采用15项遗传性耳聋相关基因检测试剂盒(微阵列芯片法)(北京博奥晶典生物技术有限公司,国械注准20173401343)。芯片洗干仪(北京博奥晶典生物技术有限公司,晶芯SlideWasher 24),微阵列芯片扫描仪(北京博奥晶典生物技术有限公司,晶芯LuxScan 10K-B)。
1.3 方法
1.3.1 DNA提取 采用打孔器取1个直径6 mm干血斑标本,采用滤纸干血斑核酸提取试剂盒进行基因组DNA提取。
1.3.2 PCR扩增 按照被检样品数的3倍准备200 µl八联排管,并在管上标记样品编号,3套管一一对应。将融化后混匀的PCR扩增试剂A、B、C按20 µl/管分别装到3个PCR扩增管中。向A、B、C3管扩增试剂中分别加入5 µl样品基因组DNA,作为PCR扩增的模板,每份PCR反应体系总体积为25 µl,在ABI 9700上进行扩增,扩增条件:阶段1:活化37℃ 10 min,95℃ 15 min;阶段2:35个循环(95℃30 s;变温速度 0.4 ℃/s;57 ℃ 30 s;变温速度0.2 ℃/s;70℃ 45 s);降温60 ℃ 10 min,12 ℃ 1 h。
1.3.3 芯片检测 将PCR产物纯化、杂交、芯片洗涤干燥(开启芯片洗干仪,设置参数:洗涤Ⅰ,42 ℃,洗涤1次,2 min,力度3;洗涤Ⅱ,42 ℃,洗涤2次,每次1 min,力度3)、使用晶芯®LuxScan™10K-B微阵列芯片扫描仪和晶芯®15项遗传性耳聋基因检测分析系统(微阵列芯片法)进行信号读取及判断和结果判读检测结果由晶芯®十五项遗传性耳聋基因检测分析系统(微阵列芯片法)自动判读。
1.3.4 结果验证 对基因芯片检测出现突变位点的样本使用一代测序法(Sanger测序法)进行验证。
1.4 统计学分析
采用SPSS 23.0软件对数据进行分析。组间比较采用Pearson和似然比卡方检验,两两比较采用Bonferroni法,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 耳聋基因突变在性别中的分布情况
3785例新生儿遗传性耳聋基因检测,总共检出255例突变,总突变率为6.74%。3785例新生儿包括2135例男孩和1650例女孩,其突变携带率分别为6.93%(148/2135)和6.48%(107/1650),男孩略高于女孩,但无显著差异(χ2=0.296,P=0.586)。
2.2 耳聋基因单基因突变检测情况
3785例新生儿中,单基因杂合突变242例,突变率6.39%。其中GJB2突变携带者134例,携带率3.55%(134/3785);SLC26A4突变携带者85例,携带率2.25%(85/3785);GJB3突变携带者12例,携带率0.32%(12/3785);线粒体耳聋基因相关突变携带者11例,携带率0.29%(11/3785),其中8例1555 A>G同质突变和3例1555 A>G异质突变。对于烟台地区新生儿耳聋基因单基因突变,GJB2突变率最高,其次是SLC26A4,GJB3和mt DNA 12S rRNA突变率最低,见表1。
表1 3785例新生儿耳聋基因单基因突变位点筛查结果
2.3 耳聋基因多位点突变检测情况
3785例新生儿中,有13例耳聋基因双位点突变,突变率0.34%(13/3785)。其中,6例非等位基因复合杂合突变(1例c.235delC/c.538 C>T、2例c.299_300delAT/IVS 7-2 A>G、1例c.299_300delAT/c .2168 A>G、1例c.235delC/IVS15+5 G>A和1例c.235delC/IVS 7-2 A>G),5例等位基因复合杂合突变(1例c.235delC/c.299_300delAT、3例c.2168 A>G/IVS 7-2 A>G和1例c.2168 A>G/C.1975G>C),2例核基因与线粒体基因复合变异(2例c.235delC/m.1555 A>G),见表2。
表2 3785例新生儿耳聋基因双位点突变筛查结果
2.4 与山东省耳聋基因突变情况比较
为了解烟台地区新生儿耳聋基因在山东省的突变情况,本研究汇总山东省各地区(烟台、东营、济宁、淄博、济南、威海)近5年新生儿耳聋基因的情况[6,8~11]。山东省各地区累计检测102903例新生儿,共检出耳聋基因 突变携带者5703例,总突变率5.54%,分别检出2781例GJB2、2143例SLC26A4、414例GJB3、303例mtDNA 12S rRNA和62例多位点复合变异,其突变率分别是2.70%、2.08%、0.40%、0.29%和0.06%。对于新生儿耳聋基因总突变率和GJB2突变率,烟台地区(6.74%,3.55%)显著高于山东省平均突变情况(5.54%,2.70%;χ2=32.20,P<0.001);而SLC26A4、GJB3和mtDNA 12S rRNA基因突变率烟台地区与山东省平均突变情况相比无显著性差异(P>0.05)。针对相同的检测方法(微阵列芯片检测法)和筛查位点(4个基因15个位点),烟台地区耳聋基因突变率与淄博地区比较,有显著差异(χ2=81.22,P<0.001)。对于新生儿耳聋基因总突变率,烟台地区(6.74%)明显高于淄博地区(5.20%)(P<0.05)。对于GJB2基因突变率,烟台地区(3.55%)与淄博地区(2.63%)相比,有显著差异(P<0.05)。对于SLC26A4、GJB3和mtDNA 12S rRNA基因突变率,烟台地区与淄博地区相比,均无显著性差异(P>0.05)。总体而言,对于新生儿耳聋基因总突变率和GJB2基因突变率,烟台地区明显高于山东省平均突变率;对于SLC26A4、GJB3和mtDNA 12S rRNA基因突变率,与山东省平均突变率相比无差异(P>0.05),见表3。
表3 山东省各地区耳聋基因突变情况汇总[%(n)]
3 讨论
耳聋是一种常见的感觉障碍性疾病,遗传、环境因素或两者共同作用,60%以上与遗传因素有关[1]。遗传性耳聋基因很多,截止目前耳聋基因至少有121个[2],其变异位点和遗传模式存在高度异质性,导致病因诊断的困难。因此,开展新生儿耳聋基因筛查,可早诊断、早治疗,有效干预耳聋的发生,尤其是母系遗传的药物性耳聋基因和迟发型耳聋基因所致。
GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体mt DNA 12S rRNA是遗传性耳聋常见的致病基因[2,12]。本研究利用微阵列芯片法检测4个基因15个位点,发现3785新生儿中有255例耳聋基因突变,突变率为6.74%,高于山东省耳聋基因平均突变情况(5.54%),也高于淄博地区报道的4个基因15个位点的耳聋突变率(5.20%)[9]。总体上,烟台地区新生儿耳聋基因的突变率高于山东省平均突变率,为烟台地区新生儿预防遗传性耳聋有一定指导意义。
我国人群中,GJB2基因是最常见的非综合征型遗传性耳聋突变基因,该基因位于13q11~q12,编码缝隙连接蛋白26,属于常染色体隐性遗传[13]。GJB2基因突变导致听力损失的个体化差异较大,但大部分患者可通过植入人工耳蜗改善听力。本研究,烟台地区GJB2基因突变率(3.55%),明显高于淄博地区(2.63%)该基因的突变率[9],也高于山东省平均突变率水平(2.70%),也高于国内人群流调GJB2基因突变率(2.42%)[1]。其中,以c.235delC检出率最高,而c.35delG位点在本研究中仅检测出1例。同时,还检出6例非等位基因复合杂合突变、2例核基因与线粒体复合突变和1例等位基因复合杂合突变。
SLC26A4基因位于7q31,含21个外显子,编码穿膜蛋白Pendrin,属于常染色体隐性遗传,其突变会导致先天性或迟发性耳聋,通常伴有前庭水管扩大[14]。本研究筛查发现85例SLC26A4单基因杂合突变(2.25%),与山东省平均突变率(2.08%)无显著差异;与淄博地区(1.88%)相比无显著差异[9]。其中,烟台地区IVS 7-2 A>G位点检出率(1.32%)最高,这与国内流调检出率(1.34%)相一致[1],而c.1229 C>T位点仅检出1例。同时,检出4例SLC26A4等位基因复合杂合突变(3例c.2168 A>G/IVS 7-2 A>G和1例c.2168 A>G/C.1975G>C)。
GJB3基因位于1p33~35,编码缝隙连接蛋白31,该基因突变可导致高频听力损失或后天性耳聋[15]。携带GJB3基因c.538C>T位点杂合突变的35例携带者(年龄23~37岁)听力正常[16]。本研究发现12例携带GJB3基因c.538C>T位点杂合的新生儿(0.32%),与山东省该基因的平均突变率(0.40%)相比无显著性差异(P>0.05),与淄博地区报道相一致[9]。遗传性耳聋基因筛查规范认为,如果携带该基因变异者通过新生儿听力初筛,建议进入常规儿童保健流程,除非有听力下降的表现,否则不需要进行定期听力检查[1]。因此,携带GJB3基因的新生儿听力正常,可以不需要定期监测听力情况;若未通过,则需要进一步行诊断性听力检查,以明确耳聋的病因。
线粒体耳聋相关基因变异(均质性变异或异质性变异)受检者及母系家族成员均为药物敏感个体,应终生慎用氨基糖苷类抗生素,以避免药物性耳聋的发生[17]。目前线粒体耳聋相关基因研究最多位点是mtDNA12S rRNA的mt.1555A>G和mt.1494C>T位点。本研究共检出13例线粒体相关耳聋基因突变,均是mt.1555A>G位点的突变,mt.1494C>T位点未检出。本研究mtDNA12S rRNA基因突变率(0.29%),与山东省该基因平均突变率(0.29%)相一致,与淄博地区报道的突变率也无统计学上的差异[9]。其中包括11例线粒体突变(8例均质性突变和3例异质性突变)和2例核基因与线粒体复合突变。对于线粒体耳聋相关基因突变的患者,避免使用氨基糖苷类抗生素,以防止药物性耳聋的发生。
综上所述,本研究通过对烟台地区3785例新生儿进行耳聋基因筛查,初步确定烟台地区常见遗传性耳聋基因的突变类型和突变率。发现烟台地区耳聋基因总突变率明显高于山东省平均突变率,尤其是GJB2基因的突变率要高于山东省其他地区,将考虑扩大研究新生儿的数量,结合听力筛查,明确烟台地区新生儿的耳聋情况。及时干预和治疗,有效预防和减少耳聋的发生。