基于多元网络的藤茶总黄酮部位抗高尿酸血症认知障碍机制研究

宋 琴，李佳川，李思颖，胡 虎，董一鸣

(西南民族大学药学院，四川 成都 610065)

高尿酸血症(hyperuricemia，HUA)是由体内嘌呤代谢紊乱而引起的代谢综合征[1]，大量流行病学调查发现，HUA不仅是引发痛风的重要生化基础，更是与原发性糖尿病、高血压、高血脂、肾功能严重损害综合症及糖代谢综合症，以及各种动脉粥样硬化、冠心病、脑卒中后遗症、心脑血管系统病变等疾病的发生发展密切相关[2].近年来研究表明，机体过高浓度的血尿酸可能引起大脑认知功能造成损伤[3-4]，严重者发展为痴呆[5].特别是随着生活水平的提高，饮食方式的改变、肥胖人群的增多，高嘌呤、高果糖饮食方式及不规律作息等诸多因素的影响，我国HUA及其并发症的发病率正逐年升高，并伴有年轻化趋势，已成为严重危害人类健康的“第四高”.目前，关于高尿酸血症导致认知功能障碍的发病机制尚不清晰，现阶段西医也无有效治疗手段.因此，早期防治尤为关键.

中医药及少数民族医药在防治慢性代谢性疾病方面具有较好的临床优势和用药经验.藤茶，又称甜茶藤、霉茶等，是葡萄科蛇葡萄属(Ampelopsis Michx.)植物显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata(Hand.-Mazz.)W.T.Wang的幼嫩茎叶，主要盛产于湖南、湖北、四川、广西等地[6]，是中南、西南少数民族地区多民族习用的药食保健茶.现代研究表明，藤茶富含黄酮类、氨基酸、多酚、多糖类等多种活性物质，黄酮类成分是其主要活性部位，含量高达45.52%[7-8]，而二氢杨梅素又是藤茶总黄酮中最主要的药效成分，约占藤茶总黄酮含量的80%，具有抗炎、抗氧化、降血糖、抗高血压、调血脂、抑菌、保肝护肝及免疫调节等多种药理活性[9-10].有报道显示，AGTF中二氢杨梅素不仅能透过血脑屏障，通过缓解神经炎症等反应来发挥神经保护作用[11]，还能降低急性睡眠剥夺小鼠海马组织的氧化应激损伤，有效改善睡眠剥夺引起的认知障碍[12-14].通过文献复习总结发现，目前，尚无关于AGTF治疗高尿酸血症及其诱导的认知障碍相关研究.因此，本文基于文献回顾和前期实验室研究基础[15-17]，拟运用网络药理学方法建立“药物-核心成分-潜在靶点-关键通路”网络，系统预测分析AGTF治疗高尿酸血症认知功能障碍的核心有效成分、潜在作用靶点及可能的作用机制，以期为药食资源藤茶防治高尿酸血症认知功能障碍的机制研究和指导临床合理用药提供理论基础，也为藤茶的进一步保健开发提供科学参考.

1 方法

1.1 AGTF有效成分挖掘

以“藤茶”、“显齿蛇葡萄”、“莓茶”、“Ampelopsis grossedentata”为检索词[17]，通过万方、知网、PubMed数据库(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)等平台进行检索，挖掘出藤茶总黄酮的有效化学成分，结合各有效成分在TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)中ADME参 数(DL≥0.1、OB≥30%)进行筛选，最终可得到AGTF的药效成分.

1.2 AGTF作用靶点及疾病的靶点预测

PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中检索各有效成分的SMILES式，并将其输入到Swiss Target Prediction平台((http://www.swisstargetprediction.ch/))中[18]，可得到AGTF有效成分潜在作用靶点的预测结果.以“高尿酸血症(hyperuricemia)”、“认知功能障碍(cognitive impairment)”、“高尿酸血症认知障碍(cognitive impairment in hyperuricemia)”为检索词，在GeneCards数据库(https://www.genecards.org)检索疾病相关靶点，对检索到的疾病靶点进行整理筛选后得到高尿酸血症认知障碍疾病靶点.同时，将上述有效成分作用靶点与疾病靶点导入Venny 2.1平台(www.cnkingbio.com/MarketDynamics/TechnologySeminar/70.html)，绘制韦恩图，可获得药物与疾病的共同靶点.

1.3 PPI网络的构建

将1.2中获得的共同靶点信息导入到STRING数据库(https://string-db.org)中，选定物种为“Homo sapiens”、置信区间＞0.4，获取蛋白质-蛋白质之间的相互作用信息，将蛋白质相互作用信息输入到Cytoscape 3.7.1软件中，构建PPI网络，并进行拓扑学分析.

1.4 生物过程及信号通路富集分析

将AGTF抗高尿酸血症认知障碍的共同靶点上传到DAVID 6.8平台(https://david.ncifcrf.gov)，进行KEGG通路富集分析和GO生物学功能注释(P＜0.05)，并将富集结果进行可视化分析.

1.5 构建“药物-成分-靶点-通路”网络

借助Cytoscape 3.7.1软件，导入药物有效活性成分与预测的作用靶点，可得“药物-有效成分-作用靶点”网络；将PPI网络与“药物-活性成分-作用靶点”网络相关联，进一步得到“药物-成分-靶点-疾病”网络，对该网络进行拓扑学分析，以节点的紧密度(Closeness)、中心度(Betweenness)和度值(Degree)3个参数的中位数为限定条件，筛选出同时大于等于3个参数中位数的节点来构建“药物-成分-靶点-疾病”核心网络.同时，将1.4筛选出来的KEGG关键信号通路映射到“药物-成分-靶点-疾病”网络结合，最终得到“药物-核心成分-潜在靶点-关键通路”网络[18].

1.6 潜在靶点组织分布情况

为了反映各潜在靶点在AGTF治疗高尿酸血症认知障碍过程中的作用，将AGTF抗高尿酸血症认知功能障碍潜在的作用靶点上传至The Human Protein Atlas(HPA)人类蛋白质图谱数据库(https://www.proteinatlas.org)中，获取各潜在靶点在组织/器官中的分布情况，并绘制“靶点-组织”图.

2 结果

2.1 AGTF有效成分筛选

以TCMSP数据库中的OB≥30%、DL≥0.10为基本条件来进行AGTF主要有效活性成分的筛选，虽然芹菜素、二氢杨梅素等活性成分口服利用度较低(OB＜30%)，检索相关文献资料可知[19-20]，这些成分均具有较高的生物活性，故也加入到网络分析中.因此，最终可以得到二氢杨梅素、山奈酚、杨梅素、芦丁、橙皮素、芹菜素、槲皮素、花旗松素、槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷、杨梅素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷10个成分作为藤茶总黄酮的有效活性成分.

2.2 相关靶点的获取

通过Swiss Target Prediction数据库对上述成分进行作用靶点预测，筛选后得到651个作用靶点，去除重复靶点后剩余191个作用靶点.从GeneCards数据库中获得高尿酸血症认知障碍相关靶点，通过去除重复项筛选后最终得到5 035个疾病靶点.同时，利用Venny 2.1平台绘制韦恩图，见图1，获得药物疾病共同靶点124个，提示这124个靶点可能在藤茶总黄酮治疗高尿酸血症认知障碍中发挥重要作用.

图1 成分-疾病靶点韦恩图Fig.1 Wayne diagram of component disease target

2.3 PPI网络的构建

124个共有靶点构建的PPI网络如图2所示，该网络由122个节点和1 074条边组成.如图3所示，对PPI聚类网络进行分析，得到聚类网络6个，其中，紫色聚类网络由24个节点网络构成的，Score值为18，由21个节点网络构成的橙色聚类网络的Score值为5.6；由5个节点网络构成的绿色聚类网络的Score值为5；由4个节点网络构成的黄色聚类网络的Score值为3.333；由4个节点网络构成的深蓝色聚类网络的Score值为3.333；浅蓝色聚类网络由3节点网络构成，Score值为3，紫色节点网络有可能会是关键靶点的聚类.

图2 PPI网络图Fig.2 PPI network diagram

图3 PPI聚类网络图Fig.3 PPI clustering network

2.4 富集分析结果

对124个共同靶点进行GO分析，得到GO生物过程结果629条(P＜0.05)，其中包括分子功能125条、生物过程431条和细胞成分73条，主要包括调控蛋白质代谢过程、MAP激酶活性的正调控、信号转导、ATP结合、MAPK级联的正调控等多种生物学过程而发挥作用.以所含基因数和P值显著性差异进行排序所得GO功能富集分析组图如图4所示.

图4 GO功能富集分析组图Fig.4 Go function enrichment analysis

KEGG通路富集结果得到121条信号通路(P＜0.05)，AGTF中潜在作用靶点富集的前20条通路结果见表1和图5，主要包括PI3K-Akt信号通路、钙信号通路、MAPK信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、HIF-1信号通路、5-羟色胺能突触、NF-κB信号通路、神经活性配体受体相互作用、神经营养素信号通路、p53信号通路、胆碱能突触、多巴胺能突触、mTOR信号通路等通路.

图5 KEGG通路富集分析气泡图Fig.5 Bubblediagram of KEGG pathway enrichment analysis

表1 KEGG信号通路基本信息Table 1 Basic information of KEGG signaling pathway

(续表1)

2.5 “药物-核心成分-潜在靶点-关键通路”网络的构建

利用PPI网络、“药物-成分-靶点”网络及Closeness、Betweenness和Degree这3个网络拓扑学参数，逐步构建“药物-核心成分-潜在靶点-疾病”核心网络，见图6.将富集显著的前20条通路关联到核心网络中，得到“药物-核心成分-潜在靶点-关键通路”网络，见图7，通过拓扑学分析可知，degree值较高的成分包括二氢杨梅素、芹菜素、山奈酚、杨梅素、槲皮素、橙皮素，提示以上成分可能是AGTF治疗疾病的核心成分；degree值靠前的靶点分别为AKT1、VEGFA、AR、APP、GSK3B、PPARG、ICAM1、MMP2、MAPK14、MMP9、EGFR、PTGS2、SRC、HIF1A、KDR、ESR1等，推测上述靶点可能是药物干预疾病的潜在作用靶点；与AGTF核心成分及潜在作用靶点关联密切的信号通路主要有PI3K-Akt信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、5-羟色胺能突触、NF-κB信号通路、胆碱能突触、多巴胺能突触、mTOR信号通路.

图6 “药物-核心成分-潜在靶点-疾病”核心网络图Fig.6 “Drug-Core Component-Potential Target-Disease”c-Core network diagram

图7 “药物-核心成分-潜在靶点-关键通路”网络图Fig.7 “Drug-Core Ingredient-Potential Target-Key Pathways”network diagram

1.6 潜在作用靶点的组织分布结果

在The Human Protein Atlas数据库中查询到潜在作用靶点(AKT1、VEGFA、AR、APP、GSK3B、PPARG、ICAM1、MMP2、MAPK14、MMP9、EGFR、PTGS2、SRC、HIF1A、KDR、ESR1)的组织分布情况，得到组织分布数据共452条，导入Cytoscape 3.7.1软件构建“靶点-组织”网络图，见图8.结合HPA数据库中靶点在各组织中的表达量可知，这些靶点集中分布于脑、肾脏、胃肠道等组织中，其中ATK1、VEGFA、APP、SRC在与尿酸、认知功能密切相关的肾脏、脑、胃肠道中均有分布，且表达量较高，MMP2、HIF1A在与尿酸密切相关的肾脏、胃肠道中高度分布.以上提示这6个靶点可能在AGTF治疗高尿酸血症认知障碍过程中发挥关键作用.

图8 靶点-组织图Fig.8 Target tissue diagram

3 讨论

近年来，HUA发病率在全球范围内持续增高，这可能与生活方式和饮食习惯改变，如高嘌呤饮食、高果糖饮料等盛行有关[21].短期HUA不会导致高血压，且无明显的线粒体功能障碍或氧化应激产生；但若不及时治疗，HUA不仅与痛风的发作直接相关，还会造成高血压、氧化应激增加、线粒体功能障碍、血管内皮功能障碍和机体炎症等危害，是心血管疾病、代谢综合征、糖尿病和急性肾损伤的诱导因素[21-23].其中，氧化应激是刺激大脑生化反应的参数之一，大脑耗氧量较高，极其容易受到氧化应激影响，从而损害大脑，导致认知障碍[24].尿酸是人体内特有的天然抗氧化剂，是引起神经退行性的主要原因[2，25].研究表明[26]，尿酸兼具抗氧化和促氧化双重作用，正常水平的尿酸可通过清除过氧化物、氧自由基来降低氧化应激；相反的，当机体尿酸水平过高时，高浓度的尿酸从抗氧化作用转变为促氧化作用，氧化损伤增加，体内自由基过多，进而损伤脑神经，从而影响认知功能[27-28].可见，血尿酸既对中枢神经系统有一定保护作用，又可对其产生威胁，尿酸水平的高低与认知功能密切相关.HUA患者并发认知障碍的诱因很多，目前研究认为，尿酸导致认知功能障碍的作用机制可能有以下两种:一方面，尿酸水平升高，造成氧化应激，进而损害血管内皮细胞功能，加重脑部缺血程度，造成神经元结构和功能改变，最终引起神经元的凋亡[29]；另一方面，尿酸通过其促氧化作用增加促氧化物蓄积，导致内皮细胞功能紊乱，脑白质缺血增加，进而诱发认知功能障碍[30].藤茶具有抗氧化、抗炎、抑菌、降脂、降糖、抗高血压和保护心血管等功效；此外，藤茶及其主要有效成分在阿尔兹海默症、脑老化等疾病进展中有一定的改善作用[31].还有研究发现，藤茶的主要成分二氢杨梅素可以通过调节肠道内特定的菌群来影响炎症以及中枢神经系统的发生，从而改善慢性睡眠剥夺引起的学习记忆障碍[12].由此可见，藤茶治疗高尿酸血症认知障碍极富潜力和优势.

由“药物-核心成分-潜在靶点-关键通路”网络分析可知，藤茶总黄酮中二氢杨梅素、芹菜素、山奈酚、杨梅素、槲皮素、橙皮素等成分可能是其治疗高尿酸血症认知功能障碍的核心成分.多项研究表明，槲皮素、二氢杨梅素、芹菜素、橙皮素均可通过下调NF-κB途径，发挥抗炎作用，改善AD中的炎症反应[32-35].二氢杨梅素通过抵抗氧化应激、炎症反应和细胞凋亡来改善认知功能障碍[36].杨梅素能够通过抑制MAPK、NF-κB信号通路，促进脊髓损伤大鼠运动功能恢复，从而缓解炎症反应、保护神经元受损[37].还有研究表明，山柰酚通过诱导细胞自噬发挥对多巴胺能神经元的保护作用，其作用可能与抑制mTOR信号通路有关[38].根据网络预测结果显示，藤茶总黄酮治疗高尿酸血症认知功能障碍的核心靶点为AKT1、VEGFA、AR、APP、GSK3B、PPARG、ICAM1、MMP2、MAPK14、MMP9、EGFR、PTGS2、SRC、HIF1A、KDR、ESR1等，主要涉及氧化应激、炎性反应、神经元细胞调控等过程，与高尿酸血症认知障碍密切相关.同时，靶点组织分布显示，核心靶点中ATK1、VEGFA、APP、SRC、MMP2、HIF1A在与高尿酸血症、认知功能关联度较高的脑、肾脏等均有分布，且表达量较高，提示这6个靶点可能在藤茶治疗高尿酸血症认知障碍过程中发挥关键作用.KEGG通路富集分析结果表明，AGTF主要活性成分治疗高尿酸血症认知功能障碍主要涉及PI3K-Akt、NF-κB、MAPK、炎症等相关信号通路.其中，PI3K-Akt信号通路可诱导一系列炎症级联反应，与高尿酸血症及其并发的认知损伤密切相关.NF-κB信号通路与机体炎症、免疫调节等关系密切，也与大脑的突触可塑性以及记忆形成过程有关.MAPK通路能被激素、细胞因子、神经递质等激活，过度激活的MAPK通路可能与细胞形态的改变以及患有阿尔兹海默症的小鼠神经元细胞减少有关.以上可推测AGTF的作用机制可能是通过调控机体内氧化应激、神经递质水平、炎症反应等多方面防治高尿酸血症认知障碍.

综上所述，藤茶总黄酮的核心成分二氢杨梅素、芹菜素、山柰酚、杨梅素、槲皮素、橙皮素等，通过作用于ATK1、VEGFA、APP、SRC、MMP2、HIF1A等多靶点，参与调控PI3K-Akt、HIF-1、MAPK、炎症等信号通路表达，提示藤茶总黄酮可能通过上述成分、靶点和通路共同发挥其减轻炎症反应、抑制氧化应激、保护神经细胞损伤等作用，从而有效改善高尿酸血症认知障碍，体现了藤茶总黄酮治疗疾病“多组分、多靶点、多途径”协同作用的特点.