微小RNA-525-5p通过靶向RECQ样蛋白5调控乳腺癌放射敏感性

梁猛

保乳术后的放射治疗在临床上已经很成熟，可以保留大多数早期乳腺癌病人的器官；即使乳房切除后，放射治疗仍然是防止术后局部复发的有效手段［1-2］。然而，放射抗性是影响乳腺癌病人预后的重要因素［3-4］。miRNA在癌症中的功能得到普遍认可，其不仅参与癌症的发生发展，在癌症的放化疗抗性中可具有重要作用［5-6］。研究报道微小RNA-525-5p（miR-525-5p）可抑制宫颈癌细胞的增殖和转移［7］。朱长春等［8］在乳腺癌放射治疗的研究中报道，miR-525-3p为乳腺癌细胞辐照后表达异常升高的miRNA之一，具有成为放射治疗新靶点的潜力。然而miR-525-5p对乳腺癌放射敏感性的影响及机制尚未清楚。RECQ解旋酶（recQ helicase）为DNA解旋酶，被称为“基因的守护者”，包括RECQL1、WRN、BLM、RECQL4和RECQL5等成员，其表达水平与乳腺癌病人的预后密切相关［9-10］。RECQL5基 因 与DNA复制、修复和转录密切相关，Peng等［11］报道，三阴性乳腺癌细胞中的RECQL5功能受损，导致DNA损伤持续存在、G2停滞，最终导致增殖停止，表明RECQL5可能是TNBC的潜在治疗靶点。RECQL5高表达促进非小细胞肺癌的转移和对顺铂的耐药性［12］，但是RECQL5在乳腺癌中的功能研究甚少。因此，本研究在2019年6月至2020年6月开展，旨在探讨miR-525-5p、RECQL5对人乳腺癌细胞MDAMB-231辐射照射敏感性的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料人乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7、BT474、非恶性乳腺上皮细胞MCF-10A均购自美国菌种保藏中心；DMEM培养基购自invitrogen公司；胎牛血清购自上海江林生物科技有限公司；噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂购自美国Sellect公司；LipofectamineTM2000购自上海阳光生物科技有限公司；二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒购自上海玉博生物科技有限公司；逆转录试剂盒购自美国Promega公司；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）购自武汉迈博瑞生物膜技术有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭（Annexin V-Fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI）凋亡检测试剂盒购自上海臻诺生物有限公司。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7、BT474以及正常乳腺上皮细胞MCF-10A使用DMEM培养基（10%胎牛血清）在37℃、5%二氧化碳的恒温细胞培养箱中进行常规培养。

1.2.2 转染和分组 将正常培养的MDA-MB-231、MCF-7、BT474、MCF-10A细胞分别标记为MDA-MB-231组、MCF-7组、BT474组、MCF-10A组。将MDA-MB-231细胞按随机数字表法分为miR-525-5p模拟物（miR-525-5p mimics）阴性对照（miR-NC）组、miR-525-5p组、RECQL5小干扰RNA阴性对照（si-NC）组、RECQL5小干扰RNA（si-RECQL5）组、miR-525-5p+RECQL5过表达空载体（pcDNA）组、miR-525-5p+RECQL5过表达载体（pcDNA-RECQL5）组。处理方法：按照脂质体LipofectamineTM2000的说明书操作，将miR-NC、miR-525-5p mimics、si-NC、si-RECQL5、miR-525-5p mimics+pcDNA、miR-525-5p mimics+pcDNA-RECQL5转 染至MDA-MB-231细 胞，转染4 h后，补充培养基继续培养48 h，在进行转染效率的检测。确定转染成功后方可用于后续试验。

1.2.3 miR-525-5p、RECQL5 mRNA的qRT-PCR检测实验 取适量对数生长期“1.2.2”各组细胞，提取细胞总RNA后，快速将其合成cDNA，再用qRT-PCR试剂盒进行miR-525-5p、RECQL5检测。以U6、GAPDH为 内 参 ，用2-ΔΔCt=［（CTmiRNA-CTU6）Treatment group-（CTmiRNA-CTU6）Control group］计算miR-525-5p的 表 达 ，2-ΔΔCt=［（CTRECQL5-CTGAPDH）Treatment group-（CTRECQL5-CTGAPDH）Control group］计算RECQL5的表达。信物序列（5'-3'）：miR-525-5p正向引物CUCCAGAGGGAUGCAC，反向引物GTGCAGGGTCCGAGGT；U6、GAPDH均采用通用内参引物序列。RECQL5引物由上海吉玛公司设计合成。

1.2.4 RECQL5的蛋白检测实验 取适量对数生长期“1.2.2”各组细胞，冰上用蛋白裂解液充分裂解并提取总蛋白，定量后用沸水浴法进行变性。将蛋白用聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白电泳，再将蛋白转移到PVDF膜。将膜用脱脂奶粉封闭2 h后浸入一抗（1∶1 500）溶液中孵育过夜（4℃）。结束后再将膜浸入二抗（1∶1 000）溶液中孵育2 h（37℃）。用超敏ECL电化学发光试剂盒对膜进行显影曝光，再用Image J分析条带灰度值。

1.2.5 细胞凋亡检测 按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒要求操作，首先将“1.2.2”各转染组细胞用500 μL的结合缓冲液悬浮，然后依次加入Annexin V-FITC、PI，避光反应后上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。细胞总凋亡率（%）为Annexin V-FITC染色阳性细胞百分比与PI阳性染色细胞百分比之和。

1.2.6 克隆形成实验检测细胞的辐射敏感性 先用Siemens Primμs直线加速器6 mV高能X线，设置剂量率3 Gy/min，以0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy垂直照射10 cm×10 cm范围，距靶源30 cm，在辐射照射结束后放置在37℃，5%二氧化碳培养箱中常规培养传代，约培养4 d。平皿底部出现肉眼可见的小白点，用甲醇固定（15 min）和吉姆萨染色（25 min），最后在显微镜下观察细胞的克隆数，并计数。

1.2.7 双荧光素酶报告基因检测实验检测miR-525-5p与RECQL5的结合力 用生物信息学在线预测网站Target Scan（http：//www.targetscan.org/）预测miR-525-5p的靶标。为了验证miR-525-5p与RECQL5之间的 靶 向关系 ，将RECQL5 3′UTR-WT（含RECQL5 3′UTR片 段）和RECQL5 3′UTR-MUT（含RECQL5 3′UTR片段突变体）克隆至载体psi-CHECK2中，构建荧光素酶报告载体psiCHECK2-RECQL5-3′UTR WT、psiCHECK2-RECQL5-3′UTR MUT。再用LipofectamineTM2000法分别将其与miR-525-5p、miR-NC、miR-525-5p抑制物（anti-miR-525-5p）、anti-miR-525-5p阴性对照（anti-miR-NC）共转染至MDA-MB-231，24 h后，按双荧光素酶报告基因检测试剂盒技术手册操作并分析检测结果。

1.2.8 统计学方法 实验数据的分析使用SPSS 21.0软件，数据相关图片的绘制使用GraphPad Prism 6.0，计量资料用表示，多组间数据比较采用单因素方差分析+LSD-t检验，两组比较采用独立样本t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌细胞中miR-525-5p、RECQL5的表达与MCF-10A组 相 比，MDA-MB-231、MCF-7、BT474组细胞中miR-525-5p mRNA表达显著降低，RECQL5 mRNA和蛋白表达均显著升高（P＜0.05）。选择与正常细胞差异有统计学意义的MDA-MB-231细胞进行后续试验研究。见图1，表1。

图1 RECQL5蛋白的表达

表1 miR-525-5p、RECQL5在乳腺癌细胞中的表达/

表1 miR-525-5p、RECQL5在乳腺癌细胞中的表达/

注：MCF-10A为人非恶性乳腺上皮细胞，MDA-MB-231、MCF-7、BT474为人乳腺癌细胞，miR-525-5p为微小RNA-525-5p，RECQL5为RECQ样蛋白5。①与MCF-10A组比较，P＜0.05。

组别MCF-10A MDA-MB-231 MCF-7 BT474 F值P值重复次数9999 miR-525-5p mRNA 1.01±0.08 0.28±0.02①0.33±0.02①0.42±0.03①508.74＜0.001 RECQL5 mRNA 1.00±0.08 1.68±0.15①1.58±0.12①1.48±0.11①58.98＜0.001 RECQL5蛋白0.99±0.07 1.43±0.11①1.38±0.12①1.53±0.14①39.55＜0.001

2.2 细胞凋亡及过表达miR-525-5p调节乳腺癌细胞的辐射敏感性与miR-NC组相比，miR-525-5p组MDA-MB-231细胞中miR-525-5p表达显著升高，细胞凋亡率显著升高，在2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy辐照下，细胞存活分数均显著降低（P＜0.05），见表2；图2，3。miR-NC组、miR-525-5p组的单击多靶模型的参数值见表3，放射增敏比（SER）值为1.659，具有增敏作用。

表2 过表达miR-525-5p对乳腺癌细胞辐射敏感性的影响/

表2 过表达miR-525-5p对乳腺癌细胞辐射敏感性的影响/

注：miR-NC为微小RNA-525-5p模拟物阴性对照，miR-525-5p为微小RNA-525-5p。

组别miR-NC miR-525-5p t值P值重复次数99 miR-525-5p 1.00±0.06 1.86±0.07 27.98＜0.001凋亡率/%7.43±0.54 25.76±1.15 43.28＜0.001存活分数2 Gy 0.89±0.06 0.67±0.54 1.22＜0.001 4 Gy 0.75±0.07 0.41±0.04 12.65＜0.001 6 Gy 0.55±0.05 0.04±0.01 30.01＜0.001 8 Gy 0.34±0.03 0.03±0.01 29.41＜0.001

图2 过表达miR-525-5p调节乳腺癌细胞的凋亡

表3 miR-NC组、miR-525-5p组的单击多靶模型参数

2.3 miR-525-5p靶向RECQL5结果如图4A所示，生物信息学预测显示，miR-525-5p与RECQL5存在靶向互补结合位点。与miR-NC组相比，miR-525-5p组WT-RECQL5细胞的荧光活性显著降低0.23±0.02，1.00±0.08；与miR-NC组相比，miR-525-5p组细胞中RECQL5相对蛋白表达量显著降低0.20±0.02，1.01±0.08，与anti-miR-NC组相比，anti-miR-525-5p组细胞中RECQL5相对蛋白表达量显著升高1.79±0.16，1.00±0.09（图4B，P＜0.05）。

图4 RECQL5的3’UTR中含有与miR-525-5p互补的核苷酸序列和RECQL5蛋白表达

2.4 敲减RECQL5对乳腺癌细胞辐射敏感性的影响与si-NC组相比，si-RECQL5组MDA-MB-231细胞中RECQL5表达显著降低，细胞凋亡率显著升高，在2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy辐照下，细胞存活分数均显著降低（P＜0.05），见表4，图5。si-NC组、si-RECQL5组的单击多靶模型的参数值见表5，SER值为1.882，具有增敏作用。

表5 si-NC组、si-RECQL5组的单击多靶模型参数

图5 敲减RECQL5对乳腺癌细胞辐射敏感性的影响：A为流式细胞仪检测细胞凋亡；B为Western blotting检测RECQL5蛋白表达

表4 敲减RECQL5对乳腺癌细胞辐射敏感性的影响/

表4 敲减RECQL5对乳腺癌细胞辐射敏感性的影响/

注：RECQL5为RECQ样蛋白5，si-NC为RECQ样蛋白5小干扰RNA阴性对照，si-RECQL5为RECQ样蛋白5小干扰RNA。

组别si-NC si-RECQL5 t值P值重复次数99 RECQL5 1.73±0.14 0.86±0.07 16.68＜0.001凋亡率/%7.50±0.51 23.16±2.01 22.66＜0.001存活分数2 Gy 0.89±0.09 0.67±0.06 6.10＜0.001 4 Gy 0.75±0.07 0.41±0.04 14.62＜0.001 6 Gy 0.55±0.05 0.04±0.01 30.01＜0.001 8 Gy 0.34±0.03 0.03±0.01 29.41＜0.001

2.5 过表达RECQL5逆转miR-525-5p对乳腺癌细胞辐射的增敏作用与miR-525-5p+pcDNA组相比，miR-525-5p+pcDNA-RECQL5组MDA-MB-231细 胞中miR-525-5p表达显著降低，细胞凋亡率显著降低，在2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy辐照下，细胞存活分数均显著升高（P＜0.05），见表6，图6。miR-525-5p+pcDNA组、miR-525-5p+pcDNA-RECQL5组的单击多靶模型的参数值见表7，SER值为1.286，具有增敏作用。

表6 过表达RECQL5对miR-525-5p的乳腺癌细胞辐射增敏作用的影响/

表6 过表达RECQL5对miR-525-5p的乳腺癌细胞辐射增敏作用的影响/

注：RECQL5为RECQ样蛋白5，miR-525-5p为微小RNA-525-5p，miR-525-5p+pcDNA为微小RNA-525-5p与RECQ样蛋白5过表达空载体，miR-525-5p+pcDNA-RECQL5为微小RNA-525-5p与RECQ样蛋白5过表达载体。①与miR-525-5p+pcDNA组比较，P＜0.05。

组别miR-525-5p miR-525-5p+pcDNA miR-525-5p+pcDNA-RECQL5 F值P值重复次数999 RECQL5 0.32±0.03 0.30±0.02 0.81±0.08 292.56＜0.001 miR-525-5p 1.00±0.08 0.98±0.07 0.46±0.04①196.19＜0.001凋亡率/%24.81±2.11 24.14±2.02 8.65±0.79①246.48＜0.001存活分数2 Gy 0.69±0.07 0.66±0.06 0.85±0.07①21.02＜0.001 4 Gy 0.41±0.07 0.38±0.04 0.72±0.05①106.30＜0.001 6 Gy 0.05±0.01 0.04±0.01 0.57±0.05①919.00＜0.001 8 Gy 0.04±0.02 0.03±0.01 0.38±0.04①510.43＜0.001

表7 miR-525-5p+pcDNA组、miR-525-5p+pcDNARECQL5组的单击多靶模型参数

图6 乳腺癌细胞凋亡及RECQL5蛋白表达：A为流式细胞仪检测细胞凋亡；B为Western blotting检测RECQL5转染情况

3 讨论

miRNA是一种有19-25个核苷酸组成的内源性、稳定的非编码小分子RNA，其可沉默靶基因的转录，抑制蛋白的翻译，进而参与癌症的进展［13］。Anne等［14］报道miR-525-3p在宫颈癌细胞、骨肉瘤细胞和脐静脉细胞融合细胞辐射照射后的表达水平明显上调，增强辐射照射的敏感性，并且miR-525-3p可靶向β抑制蛋白1（β-arrestin 1，ARRB1）、硫氧还蛋白（thioredoxin，TXN1）和热休克蛋白A9（heatshock protein A9，HSPA9），揭示miR-525-3p的上调及其直接靶标ARRB1、TXN1和HSPA9的下调是辐射后细胞存活的关键作用，提示miR-525-3p可能是改善放射敏感性的潜在靶标。Mark等［15］发现，在膀胱癌和乳腺癌中miR-525-3p为DNA修复基因结合位点miRNA之一，其表达水平异常下调，且对放射治疗后膀胱癌、乳腺癌病人的生存率具有明显的调控作用。令人遗憾的是，miR-525-5p对乳腺癌细胞辐射照射的敏感性的调控并未深入探究。本研究检测了乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7、BT474中miR-525-5p的表达，结果显示，miR-525-5p异常降低，为其在癌症中的功能研究奠定基础；进一步研究发现，过表达miR-525-5p可促进乳腺癌细胞的凋亡，增强癌细胞对辐射照射的敏感性，为提高乳腺癌的放射治疗的疗效提供新的作用靶点；通过生物信息学分析、双荧光素酶报告基因检测实验及Western blotting证实miR-525-5p可负向调控RECQL5的表达。

RECQL5是RecQ家 族DNA解 旋酶的成员，在同源重组、碱基切除修复、复制和转录中具有关键作用［16］。Lin等［17］研 究发现胃 癌 组织中RECQL5 mRNA的表达显著下调，RECQL5的低表达与肿瘤的浸润深度，组织学分化程度和TNM分期显著相关，提示胃癌病人的预后较差。Arora等［18］的研究中发现，乳腺癌中RECQL5的表达水平明显升高，这与高组织学分级、更高的有丝分裂指数、去分化、多形性和生存率低显著相关，揭示了其在乳腺癌中的致癌功能，提示RECQL5是一种有前途的乳腺癌生物标志物。Sun等［19］发现，RECQL是一种潜在的乳腺癌易感基因，其突变有助于家族性乳腺癌的发展。因此，我们推测RECQL5在乳腺癌放射治疗中具有增敏作用。本研究检测了乳腺癌细胞中RECQL5的表达，发现RECQL5高表达，这与前人的研究结果均相一致；进一步研究发现，敲减RECQL5可促进乳腺癌细胞凋亡，增强其对辐照的敏感性，更重要的是，过表达RECQL5可逆转miR-525-5p对乳腺癌细胞辐照的增敏作用，这不仅说明RECQL5具有辐照增敏作用，其辐照增敏功能还受miR-525-5p的逆向调控。这些结果为增强乳腺癌放射治疗的疗效提供新靶点，探索miR-525-5p、RECQL5在乳腺癌中的功能机制提供更充分的实验依据。

综上所述，miR-525-5p可增强乳腺癌细胞对辐射照射的敏感性，这可能与其靶向RECQL5促进癌细胞凋亡有关，为乳腺癌的放射治疗提供新方向。