生长抑素联合人转录因子叉头框蛋白D1通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路调控胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究

王书芬，倪猛，薛萌

胰腺癌作为消化道常见的恶性肿瘤，在我国，胰腺癌病人的发病率和死亡率在恶性肿瘤中分别排第10位和第6位，而早期胰腺癌病人的确诊率不高，大多数病人在确诊时已经是晚期，已经错过最佳的治疗时期，导致5年的预后生存率仅为2%～9%［1-2］。生长抑素是一种多肽类激素，在脑、胃肠和胰腺组织中含量较高，通过抑制胰酶和胰液的分泌，保护胰腺细胞［3］。刘力等［4］研究结果显示，生长抑素通过联合吉西他滨抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和上皮间质转化。人转录因子叉头框蛋白D1（FOXD1）在多种癌症中异常表达，如FOXD1在胰腺癌组织和细胞中表达上调，敲减FOXD1可以明显抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭［5］。PI3K/AKT通路与胰腺癌中发挥着重要的作用，在胰腺癌中常常被激活［6］，有研究结果显示，胰腺癌缺失位点4（DPC4）基因通过抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/帕霉素靶蛋白（PI3K/AKT/mTOR）通路抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和上皮间只转化［7］。但是关于生长抑素能否通过联合FOXD1调控PI3K/AKT通路是在胰腺癌细胞中的研究尚不明确，因此，本研究于2018年12月至2019年12月通过探讨生长抑素联合FOXD1通过PI3K/AKT通路调控胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，为胰腺癌的研究提供合理的数据支撑。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂胰腺癌细胞PANC-1购买于美国ATCC研究中心；胎牛血清（10025632C）购买于赛默飞生物、DMEM培养基（PAC0036）购买于武汉博士德生物公司；注射用生长抑素购买于扬子江集团药业公司，批号H20066708，批次20180530，规格 ：3 mg；LipofectamineTM2000转 染 试 剂 盒（10523005）购买于美国Thermo Fisher公司；pcDNA、FOXD1和引物购买于上海吉玛公司；PI3K抑制剂LY294002（HY-10123）购买于美国Med Chem Express公司；MTT试剂盒（P0102S）购买于碧云天生物公司；Transwell小室（258730236120）、Matrigel基质胶（334002）购买于美国BD公司；增殖细胞核抗原（PCNA）抗体（ab12165）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）抗体（ab204523）、基质金属蛋白酶-2（MMP-9）抗体（ab140352）、FOXD1抗体（ab128311）、磷酸化磷脂肌醇3激酶（p-PI3K）抗体（ab31075）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）抗体（ab8201）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抗体（ab120245）、蛋白激酶B（AKT）抗体（ab32451）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（ab7221）购买于购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记免疫球蛋白G（IgG）（ym-a0137G-HRP）购买于上海恒斐生物公司；Trizol试剂盒（9078）、逆转录试剂盒（RR024A）、SYBR Green Premix试剂盒（RB732A）购买于大连宝生物工程有限公司。

1.2 细胞培养和分组胰腺癌细胞PANC-1采用含有10%胎牛血清的DMEM培养基内，置于5%二氧化碳、37℃条件下的恒温培养箱内进行孵育培养，2～3 d后进行传代培养。收集生长状态良好的PANC-1细胞接种24孔细胞板内（5×104个/孔），采用生长抑素浓度为0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L处理细胞，记为各生长抑素各剂量组，其中生长抑素浓度为0 mg/L和400 mg/L，记为Control组和SST组；参照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书将pcDNA和FOXD1转染至PANC-1细胞，经过400 mg/L的生长抑素及20 mol/L的PI3K抑制剂LY294002处 理 细 胞 ，记 为SST+pcDNA组 、SST+FOXD1组和SST+FOXD1+LY294002组。

1.3 MTT检测细胞增殖收集生长状态良好的PANC-1细胞接种至96孔板中（2×103个/孔），在恒温培养箱固定培养48 h后，在每孔加入20 μL的MTT溶液，继续培养孵育4 h，出去上清液，继续加入150 μL的二甲基亚砜（DMSO），轻轻震荡混匀，在酶标仪490 nm检测细胞的光密度（OD）值，并计算半抑制浓度（IC50）值。

1.4 Transwell检测细胞迁移和侵袭细胞迁移实验：收集生长状态良好的PANC-1细胞在不含胎牛血清培养基内培养24 h，消化培养后调整密度至105个/毫升。在Transwell上室加入200 μL细胞悬液，下室内加入500 μL含胎牛血清培养基继续培养24 h。用棉签擦去未成功迁移的细胞，采用4%甲醛固定15 min后，结晶紫染色，30 min倒置在显微镜下观察迁移细胞数目。

细胞侵袭实验：将Matrigel基质胶在不含血清培养基稀释，稀释比例为1∶3，取200 μL稀释的Matrigel基质胶铺板于Transwell上室内，风干5 h，后续实验同上述迁移实验。

1.5 蛋白质印迹法检测PCNA、MMP-2、MMP-9、FOXD1和PI3K/AKT蛋白的表达收集生长状态良好的PANC-1细胞，按照BCA试剂盒测定蛋白浓度。加入45 μg上样蛋白经过12% SDS-PAGE处理转移至PVDF膜上，然后在5%脱脂牛奶封闭培养2 h，加入PCNA（1∶500）、MMP-2（1∶500）、MMP-9（1∶500）、FOXD1（1∶500）、p-PI3K（1∶500）、p-AKT（1∶500）、PI3K（1∶800）、AKT（1∶800）和GAPDH（1∶1 000）抗体，4℃过夜培养，次日加入辣根过氧化物酶标记二抗，室温下培养2 h，加入ECL试剂显影，曝光。采用Quantity One软件扫描各组蛋白条带的灰度值，然后以GAPDH为内参计算蛋白的表达。

1.6 qRT-PCR检测FOXD1 mRNA的表达收集各组PANC-1细胞采用Trizol试剂提取细胞的总RNA，紫外分光光度计检测浓度和纯度。按照逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转录合成cDNA，然后采用SYBR Green Premix试剂盒说明书进行PCR扩增 。 通 过2-ΔΔCt法 计 算FOXD1 mRNA的 表 达 。FOXD1正向引物5'-AAGAACCCGCTGGTGAAG-3'，反向引物5'-GTCCAGTAGTTGCCCTTGC-3'；GAPDH正向引物5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3'，反向引物5'-GCC ATCACGCCACAGTTTC-3'。

1.7 统计学方法通过采用SPSS 20.0分析处理实验数据，计量资料采用表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t方法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的生长抑素对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响随着不同浓度（0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L）的生长抑素处理胰腺癌细胞后，结果显示，随着不同浓度生长抑素的增加，细胞的OD值、迁移细胞数目、侵袭细胞数目、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表达逐渐降低（P＜0.05）。其中生长抑素为400 mg/L达到半数抑制（IC50），因此选择400 mg/L的生长抑素进行后续实验。见图1，表1。

图1 各组胰腺癌细胞增殖和迁移、侵袭蛋白表达

表1 不同浓度生长抑素对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响/

表1 不同浓度生长抑素对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响/

注：SST为生长抑素，OD为光密度，PCNA为增殖细胞核抗原，MMP为基质金属蛋白酶。①与0 mg/L组相比，P＜0.05。

SST浓度0 mg/L 100 mg/L 200 mg/L 400 mg/L F值P值重复次数9 9 99 OD值（490 nm）1.19±0.09 0.93±0.07①0.71±0.06①0.48±0.05①173.70＜0.001迁移细胞数目/个132.72±12.28 115.78±11.70①89.32±8.47①63.42±6.71①82.23＜0.001侵袭细胞数目/个125.56±10.37 106.11±9.52①83.51±7.78①60.23±5.26①100.28＜0.001 PCNA 1.03±0.08 0.84±0.07①0.70±0.06①0.49±0.05①107.38＜0.001 MMP-2 1.02±0.08 0.81±0.07①0.68±0.06①0.45±0.04①124.36＜0.001 MMP-9 0.99±0.07 0.79±0.06①0.64±0.05①0.42±0.04①165.52＜0.001

2.2 生长抑素对胰腺癌细胞FOXD1的表达的影响选择400 mg/L的生长抑素处理细胞，通过qRTPCR和Western blotting结果显示，与Control组相比，SST组的FOXD1 mRNA和蛋白表达明显降低（P＜0.05）；与SST+pcDNA组 相 比 ，SST+FOXD1组 的FOXD1 mRNA和蛋白表达明显增加（P＜0.05）。见图2，表2。

图2 各组胰腺癌细胞FOXD1蛋白表达

表2 生长抑素对胰腺癌细胞FOXD1表达的影响/

表2 生长抑素对胰腺癌细胞FOXD1表达的影响/

注：Control为对照组，SST为生长抑素组，SST+pcDNA为pcDNA转染组，SST+FOXD1为FOXD1转染组，FOXD1为转录因子叉头框蛋白D1。①与Control组相比，P＜0.05。②与SST+pcDNA组相比，P＜0.05

组别Control SST SST+pcDNA SST+FOXD1 F值P值重复次数9999 FOXD1 mRNA 1.02±0.06 0.47±0.03①0.49±0.04 0.67±0.05②271.64＜0.001 FOXD1蛋白0.99±0.07 0.42±0.04①0.39±0.03 0.64±0.06②250.69＜0.001

2.3 生长抑素联合FOXD1对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响与Control组相比，SST组的OD值、迁移细胞数目、侵袭细胞数目、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表达明显降低（P＜0.05）；与SST+pcDNA组相比，SST+FOXD1组的OD值、迁移细胞数目、侵袭细胞数目、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表达明显升高（P＜0.05）。见图3，表3。

表3 FOXD1过表达对生长抑素处理的胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响/

表3 FOXD1过表达对生长抑素处理的胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响/

注：Control为对照组，SST为生长抑素组，SST+pcDNA为pcDNA转染组，SST+FOXD1为FOXD1转染组，OD为光密度，PCNA为增殖细胞核抗原，MMP为基质金属蛋白酶。①与Control组相比，P＜0.05。②与SST+pcDNA组相比，P＜0.05。

组别Control SST SST+pcDNA SST+FOXD1 F值P值重复次数9999 OD值（490 nm）1.15±0.11 0.52±0.05①0.49±0.04 0.71±0.07②158.03＜0.001迁移细胞数目/个129.32±11.44 66.79±7.22①62.73±6.82 86.88±8.46②111.09＜0.001侵袭细胞数目/个123.57±11.63 63.72±6.51①65.78±5.59 81.52±7.30②105.95＜0.001 PCNA 1.01±0.08 0.47±0.05①0.45±0.04 0.66±0.06②171.98＜0.001 MMP-2 0.99±0.07 0.43±0.04①0.40±0.03 0.62±0.06②241.09＜0.001 MMP-9 0.97±0.07 0.44±0.05①0.43±0.04 0.67±0.05②201.68＜0.001

图3 各组胰腺癌细胞增殖及迁移、侵袭蛋白表达

2.4 生长抑素联合FOXD1调控PI3K/AKT信号通路的表达与Control组相比，SST组的p-PI3K、p-AKT蛋白表达明显降低（P＜0.05）；与SST+pcDNA组相比，SST+FOXD1组p-PI3K、p-AKT蛋白表达明显升高（P＜0.05）。见图4，表4。

表4 过表达FOXD1对生长抑素处理的胰腺癌细胞PI3K/AKT通路相关蛋白表达的影响/

表4 过表达FOXD1对生长抑素处理的胰腺癌细胞PI3K/AKT通路相关蛋白表达的影响/

注：Control为对照组，SST为生长抑素组，SST+pcDNA为pcDNA转染组，SST+FOXD1为FOXD1转染组，PI3K为磷脂酰肌醇3激酶，p-PI3K为磷酸化磷脂肌醇3激酶，AKT为蛋白激酶B，p-AKT为磷酸化蛋白激酶B。①与Control组相比，P＜0.05。②与SST+pcDNA组相比，P＜0.05。

组别Control SST SST+pcDNA SST+FOXD1 F值P值重复次数9 999 p-PI3K/PI3K 1.03±0.08 0.43±0.04①0.40±0.03 0.62±0.05②265.99＜0.001 p-AKT/AKT 0.99±0.07 0.39±0.03①0.42±0.04 0.65±0.06②251.43＜0.001

图4 各组胰腺癌细胞PI3K/AKT通路相关蛋白表达

2.5 加入LY294002抑制剂对PI3K/AKT通路相关蛋白表达的影响与SST+FOXD1组相比，SST+FOXD1+LY294002组的p-PI3K、p-AKT蛋白表达明显降低（P＜0.05）。见图5，表5。

表5 LY294002对生长抑素与FOXD1联合处理的胰腺癌细胞PI3K/AKT通路相关蛋白表达的影响

图5 各组胰腺癌细胞PI3K/AKT通路相关蛋白表达

2.6 生长抑素联合FOXD1调控PI3K/AKT通路对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响与SST+FOXD1组 相 比 ，SST+FOXD1+LY294002组 的FOXD1 mRNA及蛋白表达、OD值、迁移细胞数目、侵袭细胞数目、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表达明显降低（P＜0.05）。见图6，表6。

表6 LY294002对生长抑素与FOXD1联合处理的胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响/

表6 LY294002对生长抑素与FOXD1联合处理的胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响/

注：SST+FOXD1为FOXD1转染组，SST+FOXD1+LY294002为生长抑素及PI3K抑制剂LY294002处理组，FOXD1为转录因子叉头框蛋白D1，OD为光密度，PCNA为增殖细胞核抗原，MMP为基质金属蛋白酶。

组别SST+FOXD1 SST+FOXD1+LY294002 t值P值重复次数99 FOXD1 mRNA 0.72±0.06 0.37±0.04 14.56＜0.001 FOXD1蛋白0.93±0.05 0.35±0.03 29.84＜0.001 OD值（450 nm）0.69±0.06 0.53±0.05 6.15＜0.001迁移细胞数目/个83.72±7.20 67.19±6.46 5.13＜0.001侵袭细胞数目/个78.57±7.52 62.52±5.16 5.28＜0.001 PCNA 1.01±0.07 0.41±0.05 20.93＜0.001 MMP-2 0.97±0.07 0.39±0.04 21.58＜0.001 MMP-9 0.99±0.07 0.44±0.04 20.47＜0.001

图6 各组胰腺癌细胞FOXD1蛋白及增殖和迁移、侵袭蛋白表达

3 讨论

胰腺癌多发于糖尿病病人和慢性胰腺炎病人，临床症状表现为腹痛、腹部饱胀不适和消瘦无力等现象，受吸烟、高脂肪、饮酒、饮用咖啡和环境等因素影响［8-9］。生长抑素作为临床治疗肿瘤和癌症常见的药物，在抗癌方面具有一定的作用效果，最早是由Krulich于1968年在大鼠下丘脑生长激素释放因子，是一种抑制生长激素的物质，经过Brazeau分离提纯［10-11］。生长抑素不仅能减少胰腺、胃小肠和胆囊等分泌，还能够减少酶活性，对肿瘤细胞具有保护作用，可以作为抗肿瘤的一种药物［12］。有研究发现，生长抑素联合吉西他滨抑制胰腺癌细胞增殖［13］。朱威等［14］研究结果显示，生长抑素药物通过下调环氧化酶2（Cox-2）抑制胃癌细胞增殖和诱导细胞的凋亡。丁瑞贤［15］研究结果显示，生长抑素通过调控Wnt/β-连环蛋白通路抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化。本研究结果显示，结果不同浓度的生长抑素抑制胰腺癌细胞，结果显示，细胞的OD值、迁移细胞数目和侵袭细胞数目明显降低，PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表达下调，说明生长抑素可以明显抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，具有抗肿瘤的作用。

FOXD1是FOXD家族成员之一，位于染色体5q12区域，广泛存在于真核组织和细胞中［16］，有研究发现，FOXD1在结直肠癌组中表达上调，与肿瘤分化程度、分期、淋巴结转移和不良预后显著相关，沉默FOXD1可以抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭，并促进其凋亡［17］。Pan等［18］研究结果显示，FOXD1在大肠癌组织中表达上调，异常表达与一些临床表现（肿瘤大小、分化、TNM分期和淋巴结转移等）有关，敲低FOXD1减弱了大肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。本研究结果显示，生长抑素可以下调FOXD1 mRNA和蛋白表达，过表达FOXD1可以逆转生长抑素对胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的作用，说明生长抑素通过上调FOXD1发挥在胰腺癌细胞中的作用。PI3K家族可以参与多种通路（PI3K、PTEN、AKT）调控肿瘤细胞的生长、转移等［19］，Zhang等［20］研究结果显示鸢尾素可以通过下调PI3K/AKT通路抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡。经过生长抑素处理细胞后，p-PI3K、p-AKT蛋白表达下调，过表达FOXD1则上调p-PI3K、p-AKT蛋白表达，说明生长抑素通过联合FOXD1调控PI3K/AKT通 路 的 表 达 。 加 入PI3K抑 制 剂LY294002处理后，p-PI3K、p-AKT蛋白表达下调，细胞的OD值、迁移细胞数目和侵袭细胞数目明显降低，FOXD1 mRNA表达下调，FOXD1、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表达下调，这说明生长抑素通过联合FOXD1调控PI3K/AKT通路影响胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。

综上所述，生长抑素通过上调FOXD1的表达抑制PI3K/AKT通路抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。