二甲双胍对具核梭杆菌与结直肠癌的影响

魏攀凤 张小燕

根据全球数据统计，结直肠癌（colorectal cance,CRC）的发病率和死亡率在近年来一直处于明显上升趋势，在全球癌症中位居第三，死亡率第二。从疾病发展趋势角度根据不同年龄和区域进行分析统计，年轻人的患病率升高，且与往年发病水平相比发病率有所上升。CRC发生和后续发展与环境、遗传因素、不良饮食结构、肠道微生物群体失衡[1-2]、肠黏膜发生慢性炎症反应等有关，各种危险因素相互作用而引起机体结直肠恶性肿瘤的产生[3]。具核梭杆菌（fusobacterium nucleatum, Fn）是CRC发生的可疑病原体之一，具体的致病机制还不清楚，有待进一步研究。目前，有报道指出Fn的肠道感染途径为通过致病菌异常定植在肠道黏膜中致使肠黏膜发生慢性炎症反应[4]，并激活机体免疫应答从而导致恶性细胞生成，Fn与CRC发展和疾病转归密切相关，Cuellar-Gómez等[5]的研究表明，在CRC患者中Fn明显富集的患者淋巴转移和复发率均高于平均水平。

二甲双胍是目前全球临床上应用最为广泛的2型糖尿病口服药物，进入机体后主要分布于肝脏，药物作用机制是抑制肝脏葡萄糖异生。目前有实验表明二甲双胍联合抗肿瘤药物使用能使细胞周期停滞[6-8]，异常激活AMPK通路和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）等通路[9]。其还可通过降低机体胰岛素水平起到抑制肿瘤细胞增殖和有丝分裂[10]，减少机体脂肪组织生成从而抑制由脂肪细胞介导的恶性肿瘤增殖及转移。Huang等[11]给予4～5周的小鼠二甲双胍（250 mg/kg）每天口服灌喂和Fn（109菌落单位）每周2次共同持续喂养12周，于18周后进行结肠组织检测发现给予二甲双胍组结肠结瘤数减少、瘤体积较小，在组织学上减轻了Fn诱导瘤的形成。综上表明二甲双胍对肠道微生物组成和代谢功能障碍均有一定的影响，其可降低恶性细胞增殖，抑制肠道肿瘤形成和逆转Fn诱导的肿瘤形成。

E-cadherin是一种Ca2+依赖黏附糖蛋白，为单程跨膜蛋白，可介导细胞间黏附。其表达缺失是细胞上皮-间叶转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）最重要的标志性变化，也是上皮肿瘤细胞发生侵袭、迁移的前提条件[12]。有实验报道发现二甲双胍可诱导CRC肿瘤细胞中细胞-细胞黏附连接的重建[12-13]，表现为 E-cadherin、p120-catenin和β-catenin 定位修饰。且随着黏着斑激酶（FAK）的抑制，毒力因子FadA黏附素与E-cadherin蛋白结合，激活β-catenin因子，介导致病菌附着和侵袭上皮细胞，刺激肿瘤细胞的生长。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

人CRC细胞株SW480购自中国科学院上海细胞库；Fn ATCC25586菌株购自美国ATCC公司；DMEM培养基购自美国Hyclone公司；二甲双胍购自美国Sigma公司；兔抗人E-cadherin单克隆抗体购自美国Abcam公司。

1.2 实验方法

将CRC标准菌株SW480细胞在10%胎牛血清和含抗DMEM培养基中37 ℃、10% CO2培养，胰酶消化传代生长，配成8×105/ml的细胞悬液24孔板培养24 h后备用分组。Fn调节成浓度1×108/ml备用。将癌细胞密度配置为1×105接种直96孔板中，根据实验要求分组，对照组：SW480组；Fn组：Fn+SW480组[细胞与菌比例按照感染复数（MOI）（100∶1）共培养]；二甲双胍组：二甲双胍+SW480（二甲双胍5 mmol/L）；联合组：二甲双胍+Fn+SW480[细胞与菌比例按照MOI（100∶1），二甲双胍5 mmol/L]。用MTT法采用吸光度OD值（490 nm）计算24 h、48 h、72 h活细胞数。另各组培养处理至48 h用Western blotting检测法，以内参的灰度值作为对比，取对比值作为E-cadherin蛋白相对表达量，以上实验重复3次检测取其均值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，多组比较采用单向方差分析，两两比较用最小显著差异法（LSD）t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 二甲双胍对SW480增殖的影响

相对于对照组和Fn组，含二甲双胍的培养组24 h、48 h及72 h均出现OD值明显低于对照组和Fn组（P＜0.05）。见表1、图1。

表1 二甲双胍对SW480增殖的影响(n=5,±s)

表1 二甲双胍对SW480增殖的影响(n=5,±s)

注：与对照组比较，aP＜0.05；与Fn组比较，bP＜0.05

组别 24 h 48 h 72 h对照组 0.42±0.05 0.53±0.07 0.59±0.06 Fn组 0.45±0.02a 0.69±0.07a 0.85±0.07a二甲双胍组 0.39±0.02ab 0.37±0.05ab 0.34±0.04ab联合组 0.40±0.01ab 0.41±0.03ab 0.40±0.03ab F值 12.215 1 009.915 6 076.907 P值 0.02 0.000 0.000

图1 二甲双胍对SW480细胞增殖的影响

2.2 二甲双胍对SW480细胞E-cadherin蛋白表达的影响

与对照组和Fn组比较，二甲双胍组、联合组E-cadherin蛋白表达量明显升高（P＜0.05）。见表2、图2。

图2 二甲双胍对SW480细胞E-cadherin蛋白表达的影响

表2 二甲双胍对SW480细胞E-cadherin蛋白表达的影响(n=3,±s)

表2 二甲双胍对SW480细胞E-cadherin蛋白表达的影响(n=3,±s)

注：与对照组比较，aP＜0.05；与Fn组比较，bP＜0.05

组别 E-cadherin蛋白对照组 1.35±0.10 Fn组 1.21±0.02二甲双胍组 1.86±0.10ab联合组 1.62±0.15ab F值 23.775 P值 0.00

3 讨论

CRC是目前临床上最常见的恶性肿瘤之一，病理机制目前尚未明确，转移和复发是导致CRC患者死亡的主要原因。CRC的发生是多种因素造成的[14-15]。EMT是肿瘤细胞形成标志物之一，并导致侵袭和转移。目前，无创有效的筛查和高效治疗方案还未发现，因此探究CRC发生发展的具体机制及转归对于未来制定预防、筛查和治疗策略至关重要。

本实验通过建立二甲双胍（5 mmol/L）与Fn和SW480（MOI：100∶1）共培养，记录24 h、48 h、72 h的OD值，结果表明Fn可以促进CRC细胞的增殖，二甲双胍能抑制CRC的增殖；其作用在48～72 h明显高于24 h。其可能的作用机制是二甲双胍对肿瘤细胞EMT具有抑制潜能。因E-cadherin是细胞EMT的主要标志物，能表达致病体的侵袭和迁移能力从而逆转EMT途径[16-17]，故也被确定为疾病治愈的影响因素。另有动物实验表明二甲双胍可通过调节肠道微生物菌群的组成抑制肠癌的发生[18]。二甲双胍通过调节菌群起到抑制炎症反应促发细胞增殖途径的潜在作用。本实验显示二甲双胍抑制肿瘤细胞生长在联合组中也体现减轻了Fn诱导肿瘤细胞的增殖，考虑是否存在逆转Fn诱导的致瘤性。同时发现肿瘤细胞EMT标志物E-cadherin在联合组中的表达量也比对照组和Fn组高，提示二甲双胍可促使肿瘤细胞与E-cadherin结合，抑制Fn附着和侵入上皮细胞，从而降低CRC的发生和浸润转移。

综上所述，二甲双胍可能通过促使肿瘤细胞与E-cadherin结合，抑制Fn附着和侵入上皮细胞，从而降低CRC的发生和浸润转移。