MicroRNA-27b在高血压脑出血大鼠脑组织中的表达及对星形胶质细胞生物学功能的影响*

肖仕和，李钢，周奋，刘珍，刘仲海

（海南省第三人民医院神经外科，海南三亚 572022）

高血压脑出血（hypertensive intracerebral hemorrhage, HICH）是高血压最严重的并发症之一，也是主要的致残性疾病之一[1]。流行病学资料显示，HICH 主要影响50～70 岁人群，30 d 病死率可达32%～50%，即使存活，约70%的患者仍会出现神经功能障碍，仅28%～35%的患者具有独立的生活技能[2-3]。HICH 发病后神经元的损伤是导致神经功能障碍及其他并发症的病理基础，而星形胶质细胞参与了HICH 发病后对神经元的保护和重建[4-5]。星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的细胞类型，参与神经元的营养、保护，维持血脑屏障，并协助跨突触的信号传递过程[6]。在出现脑组织损伤后，星形胶质细胞被激活，并可通过分泌各种细胞因子参与损伤后的修复，星形胶质细胞大量的凋亡影响HICH 的恢复[7-8]。 微RNA（microRNA,miRNA）是一种内源性的、约为22～25 个核苷酸长度的RNA，参与细胞增殖、凋亡、分泌等过程及细胞功能的调控[9]。microRNA-27b（miR-27b）是近年来发现的与HICH 有关的miRNA，有研究发现降低miR-27b 的表达会缓解HICH 大鼠的脑损伤[10-11]，但是其对星形胶质细胞的影响仍不清楚。本文主要分析miR-27b 在HICH 大鼠脑组织中的表达及对星形胶质细胞生物学功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

自发性高血压（spontaneous hypertension，SHR）大鼠（血压：160～180 mmHg）、健康的同源性WKY大鼠，12月龄，SPF 级，雄性，体重190～210 g（上海斯莱克实验动物中心），实验动物使用许可证号:SYXK（ 琼）2022-0013；大鼠星形胶质细胞（BNCC338613，北京北纳科技有限公司）。本研究经医院医学伦理委员会批准。

苏木精-伊红和TUNEL 染料（C1091，上海碧云天生物技术有限公司）；RPMI 1640 培养基和抗体（美国Gibco 公司）；miR-27b 的类似物（mimic）、抑制剂（inhibitor）及阴性对照（negative control, NC）（中国吉玛公司）；TRIzol 试剂（北京艾德莱生物科技有限公司）；TRIzol 和miRNeasy Mini 试剂盒（德国QIAGEN有限公司）；SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（中国TaKaRa 公司）；CCK-8 试剂盒（C0037，上海碧云天生物技术有限公司）；凋亡试剂盒（Annexin V-FITC 和PI）（中国耶森实业有限公司）；酶标仪（日本Bio-Rad公司）；流式细胞仪（美国Becton 公司）；数码相机（IXUS，日本佳能公司）和光学显微镜（ECLIPSE Ni，美国Nikon 公司）。

1.2 HICH大鼠模型复制

选取15 只健康WKY 大鼠作为对照组，15 只SHR 大鼠作为HICH 组。通过自体血脑内注射法复制HICH 模型[8]：大鼠腹腔注射10% 水合氯醛（400 mg/kg）麻醉后固定在立体定向仪中，调整仪器，使大鼠前囟和后囟处于同一平面，在前囟后侧0.2 mm 处钻孔，然后断尾取自体血50 μL，进针6.0 mm（尾壳核处）注入50 μL 自体血，缓慢注射持续3 min，留针7 min。对照组进行相同的操作但不注射自体血。通过改良大鼠神经功能缺损评分（mNSS）评估模型复制结果。24 h 后将大鼠安乐死，取脑组织用于后续实验检测。

1.3 检测方法

1.3.1 HE染色大鼠安乐死后取脑组织，室温下用4%多聚甲醛固定6 h，乙醇脱水后用石蜡包埋，然后切成5 μm 厚的切片，并将这些切片贴到载玻片上，室温下使用苏木精染色10 min，自来水冲洗1～2 min 后，将其置于10%冰醋酸中10 s，然后再置于1%氨水中，直到切片变蓝，再用自来水清洗1～2 min 后，放入伊红液染色10 s，脱水后置于二甲苯中2 min，最后用中性胶封片，光学显微镜下观察。

1.3.2 TUNEL染色1.3.1 中的切片用二甲苯脱石蜡2 次，每次10 min，经过梯度乙醇脱水（乙醇浓度：100%、95%、90%、80%、70%），在37°C 的潮湿暗箱中用50 μL 的TUNEL 反应溶液处理切片60 min，随后将50 μL 辣根过氧化物酶标记链霉亲和素加入其中孵育30 min，用DAPI 对细胞核进行荧光染色，常规脱水、脱色、固定。检测细胞凋亡率并用光学显微镜放大400 倍捕获图像，计算TUNEL 阳性细胞数。细胞凋亡指数=（TUNEL 阳性细胞数/总细胞数）×100%。

1.3.3 qRT-PCR 检测大鼠脑组织及各组细胞miR-27b mRNA 相对表达量收集大鼠脑组织及各组细胞，采用TRIzol 法从大鼠脑组织及各组细胞中提取总RNA，并使用Nanodrop 2000 进行定量。用miRNeasy Mini 试剂盒分离miRNA 并进行逆转录合成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTM进行qRTPCR：95°C 预变性2 min，95°C 变性30 s 退火20 s，72°C 延伸20 s，共40 个循环。miR-27b mRNA 正向引物：5′-ACACTCCAGCTGGGAGAGCTTAGCTGATT G-3′，引物长度为 30 nt；反向引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCYAGTTGA GGTTCAC-3′，引物长度为43 nt；U6 正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，引物长度为17 nt；反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，引物长度为20 nt。以U6 为内参对照，使用2-ΔΔCt法计算目的基因miR-27b mRNA 相对表达量。

1.4 星形胶质细胞分组和转染

星形胶质细胞培养于RPMI 1640 完全基中，培养基含有10%的胎牛血清、0.1 mg/mL 的链霉素及100 u/mL 的青霉素。将细胞在37°C，95%湿度条件下培养于5%二氧化碳培养箱中。细胞分为3 组，NC 组、miR-27b mimic 组及miR-27b inhibitor 组，根据组别分别转染miR-27b mimic、miR-27b inhibitor质粒来过表达和抑制miR-27b 水平。将细胞在6 孔板中培养，当细胞达到60% 汇合后，添加Opti（100 μL）和LipofectamineTM2000（5 μL）并孵育5 min作为试剂A。加入Opti（100 μL）和miR-27b mimic/inhibitor 质粒（20 ng/μL）并孵育5 min 作为试剂B。将A、B 试剂混合在一起并孵育20 min。16 h 后，更换培养基并收获细胞。NC 组细胞转染等量的NC 质粒作为对照。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖活力

将100 μL 的细胞悬浮液添加到96 孔板，分别孵育24 h、48 h 后，将体积为10 μL 的CCK-8 溶液添加到每个孔中并孵育2 h，用酶标仪检测450 nm波长处的光密度（OD）值。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡率

将细胞用1×PBS 洗涤并悬浮在100 μL 结合缓冲液中，分别加入5 μL 的Annexin V-FITC 和10 μL的PI，并在室温下黑暗中孵育10～15 min，最后将400 μL 的结合缓冲液添加到样品中，并在1 h 内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较用单因素方差分析，进一步两两间的比较采用SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠脑组织病理学检查结果

光学显微镜下观察到，对照组神经元分布均匀，细胞核结构清晰；HICH 组的细胞核染色变深，并且出现间质性水肿。见图1。

图1 大鼠脑组织病理学改变 （HE染色×200）

2.2 大鼠神经元凋亡情况

光学显微镜下观察到，细胞核为蓝色，棕褐色为TUNEL 染色阳性表达细胞，即凋亡（见图2）。HICH 组与对照组细胞凋亡指数分别为（35.91±3.24）和（2.75±0.36），两组比较，差异有统计学意义（t=39.400，P=0.000）， HICH 组高于对照组。

图2 大鼠神经元凋亡情况 （TUNEL染色×400）

2.3 两组大鼠脑组织中miR-27b mRNA相对表达量的比较

HICH 组大鼠脑组织中miR-27b mRNA 相对表达量为（3.45±0.48），对照组为（1.00±0.12），两组比较，差异有统计学意义（t=19.180，P=0.000），HICH 组高于对照组。

2.4 3 组星形胶质细胞miR-27b mRNA 相对表达量的比较

转染后，3 组细胞miR-27b mRNA 相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），miR-27b mimic 组高于NC 组（P＜0.05），miR-27b inhibitor 组低于NC 组（P＜0.05）。见表1。

表1 3组星形胶质细胞miR-27b mRNA相对表达量的比较 （±s）

表1 3组星形胶质细胞miR-27b mRNA相对表达量的比较 （±s）

注：†与NC组比较，P ＜0.05。

组别NC组miR-27b mimic组miR-27b inhibitor组F 值P 值miR-27b mRNA 1.00±0.09 3.86±0.35†0.62±0.05†424.448 0.000

2.5 3组星形胶质细胞增殖活力的比较

3 组星形胶质细胞增殖活力比较，差异有统计学意义（P＜0.05），miR-27b mimic 组低于NC 组（P＜0.05），miR-27b inhibitor 组高于NC 组（P＜0.05）。见表2。

表2 3组星形胶质细胞增殖活力的比较 （±s）

表2 3组星形胶质细胞增殖活力的比较 （±s）

注：†与NC组比较，P ＜0.05。

组别NC组miR-27b mimic组miR-27b inhibitor组F 值P 值48 h 0.81±0.08 0.65±0.07†0.97±0.09†23.753 0.000 24 h 0.46±0.04 0.40±0.05†0.53±0.06†9.896 0.000

2.6 3组星形胶质细胞凋亡率比较

流式细胞术检测结果显示，3 组星形胶质细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），miR-27b mimic 组高于NC 组（P＜0.05），miR-27b inhibitor 组低于NC 组（P＜0.05）。见表3和图3。

表3 3组星形胶质细胞凋亡率的比较 （%，±s）

表3 3组星形胶质细胞凋亡率的比较 （%，±s）

注：†与NC组比较，P ＜0.05。

组别NC组miR-27b mimic组miR-27b inhibitor组F 值P 值凋亡率5.73±0.56 17.89±1.40†3.12±0.35†466.797 0.000

图3 miR-27b对星形胶质细胞凋亡的影响

3 讨论

HICH 多由长期的高血压和颅内动脉粥样硬化引起，导致患者颅内小动脉破裂引起实质内出血[12]。HICH 早期无症状，多在剧烈运动或情绪起伏状态下突然出现剧烈头痛、烦躁或呕吐，在数分钟或数小时内进展为嗜睡、昏迷甚至死亡[13-14]。但是目前尚无有效治疗HICH 和改善患者神经功能的方法。

miRNA 是近年来的研究热点，其可通过碱基配对识别并结合mRNA 的3'-端的非翻译区域，进而诱导mRNA 的降解或者抑制翻译[15-16]。动物实验表明脑卒中大鼠血浆中miR-27b 的水平显著上调，并与病情严重程度有关[17-19]。本研究通过对SHR 大鼠进行自体血脑内注射复制HICH 大鼠模型，结果显示复制后模型有明显的脑组织损伤，发现大量细胞凋亡，并且出血脑组织中miR-27b mRNA 相对表达量显著升高，这初步提示miR-27b 参与HICH后的组织损伤和神经元凋亡，但是miR-27b 对何种细胞产生影响仍不清楚。

星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，在维持微环境稳定性和神经回路功能方面起着至关重要的作用，在正常条件下，星形胶质细胞负责调控钾离子缓冲和神经元代谢，并通过分泌细胞因子营养神经元[20-21]。而在HICH 等病理状态下，星形胶质细胞会被激活，不仅通过分泌炎症细胞因子帮助清除受损组织，并且还参与神经元的重建[22]。近年来研究[23]表明星形胶质细胞受到miRNA 的调节，如miR-194-5p 通过直接靶向神经外营养蛋白抑制脂多糖诱导的星形胶质细胞活化。miR-27b 在调节细胞存活、增殖及凋亡中起到关键作用，如下调miR-27b 的表达会通过靶向口腔扁平苔藓中的PLK2 的表达促进角质形成细胞增殖[24]。也有研究[25-26]显示，提高miR-27b 水平会促进弥漫性大B 细胞淋巴瘤细胞的凋亡。为分析miR-27b 对星形胶质细胞的影响，本研究通过转染分别复制了miR-27b 过表达和沉默的星形胶质细胞模型，并通过检测转染后miR-27b 的水平验证了转染结果。CCK-8 实验发现过表达miR-27b 显著抑制了星形胶质细胞的增殖能力，并促进星形胶质细胞凋亡；而miR-27b 水平的降低则促进了星形胶质细胞的增殖活力，并抑制了凋亡。结合本次的细胞实验和动物实验，提示HICH 发生后miR-27b水平的升高诱导星形胶质细胞的凋亡，参与HICH的损伤。然而，本次研究也有许多不足之处，首先，miR-27b 调控星形胶质细胞增殖和凋亡的机制仍需要进一步分析；其在HICH 中的作用仍需要进一步的动物实验验证；并且miR-27b 在HICH 中的意义也需要临床研究证实。

综上所述，miRNA-27b 在HICH 大鼠脑组织中显著升高，抑制星形胶质细胞的增殖并促进其凋亡。这提示miRNA-27b 可能是诊断和治疗HICH 的新靶点。