60Co-γ射线辐射对金花菜种子生物学效应的影响

陈莉敏 李达旭,* 白史且 张 玉 毛德才 廖兴勇 杨晓玲

(1 四川省草原科学研究院，四川 成都 611731；2 四川省林业和草原局，四川 成都 610081；3 成都市农林科学院，四川 成都 611134；4 成都市龙泉驿区第一人民医院，四川 成都 610100)

金花菜(MedicagopolymorphaL., bur clover)，又称草头[1]、南苜蓿[2]、肥田草等，属豆科(Leguminosae)苜蓿属(Midicago)一年生或越年生植物[3]，原产于地中海地区，广泛分布于欧洲、亚洲和非洲北部，在我国主要生长在长江流域以南，常为栽培或半野生状态，适应性良好[4]。金花菜生长迅速、营养丰富，蛋白质含量可达25%以上[5]，氨基酸、维生素、矿物质、微量元素丰富[6]，具有菜用、饲用、药用、绿肥、边坡绿化等多种用途。国外金花菜品种有Santiago、Serena、Scimitar、Cavalier、Armadillo[3]和Anglona[7]等，但均未引入国内；我国现有淮扬金花菜[8]、楚雄南苜蓿[9]、川南金花菜[3]3个品种，均为菜用和饲用品种。农民可选择的品种不多，药用或具有抗逆特性的新品种研发进展缓慢，育种途径较为单一，种质资源的匮乏限制了金花菜的育种及利用。利用现代育种技术开展金花菜育种研究，创制具有优良性状或抗逆特性的新材料，对丰富金花菜种质资源多样性，满足农业生产需求具有积极的作用。

辐射育种是核技术农业应用的重要领域。利用放射性同位素放出的射线(如α射线、γ射线)照射农作物种子、植株或其他器官，使种子或植株发生遗传变异，再经过人工选种和培育，得到新的优良品种[10]。目前，辐射诱变育种在植物突变品种培育和新资源创制等领域得到了广泛应用[11]。60Co-γ射线辐射是植物诱变育种的常用方法，具有控制辐射条件便利、试验重演性好、育种效果良好等特点[12]，但仍鲜见有关金花菜辐射育种的相关研究。鉴于此，本研究以川南金花菜种子为材料，利用不同剂量的60Co-γ射线辐射金花菜种子，旨在了解60Co-γ射线对金花菜种子萌发和植株生长的影响，确定60Co-γ射线辐射金花菜的适宜剂量，为金花菜辐射育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为精选川南金花菜干种子，由四川省草原科学研究院提供。

1.2 试验方法

1.2.1 种子辐射 2019年9月，将金花菜干种子送至四川省农业科学院辐射场进行60Co-γ射线辐射处理，辐射剂量为0(对照)、400、600、800、1 000、1 200 Gy，剂量率为2 Gy·min-1，每个处理共300粒，重复3次。

1.2.2 种子萌发效应 将辐射处理的种子进行表面消毒，采用培养皿滤纸发芽法，将种子均匀平铺于带有3层湿润滤纸的培养皿上，每皿50粒，重复3次，放置于恒温培养箱中25±2℃培养，观察种子14 d内发芽情况。

1.2.3 植株生长效应 将种子播种于育苗盘(540 mm×280 mm，32孔，每孔110 mL)中，每个处理播种96孔，每孔1粒，放置于四川省草原科学研究院成都市大邑县韩场镇实验基地进行田间培养，每天浇水1次，观察植株出苗和生长情况。幼苗生长2个月后，统计幼苗存活率。生长第3个月进入分枝期，每个处理随机选择5株，测定株高和分枝数。2020年3月6日—4月18日植株进入花期和结荚期，每个处理固定选择5株，每周记录株高、开花数量、结荚数量。4月19日—20日采收荚果。

1.2.4 辐射半致死剂量的确定 参考已有研究方法[13-14]，以金花菜种子在不同辐射剂量下幼苗的存活率为纵坐标(y)，辐射剂量为横坐标(x)，拟合直线回归方程y=a+bx，计算存活率为50%时对应的辐射剂量，得到金花菜种子辐射的半致死剂量(the semi-lethal dose, LD50)。

1.3 分析方法

采用Excel 2007统计数据和作图，采用SPSS 22.0分析试验结果，对金花菜种子萌发率和植株生长指标数据采用单因素方差分析，对金花菜开花和结荚数量采用重复测量分析。

2 结果与分析

2.1 60Co-γ射线辐射对金花菜种子萌发的影响

由图1可知，金花菜在发芽7 d内发芽迅速，在10～14 d发芽速度变慢，经60Co-γ射线辐射的种子发芽速度和发芽率均高于对照组(0 Gy)。在发芽第14天，5个处理组(400～1 200 Gy)的种子发芽率分别为89.58%、76.56%、73.96%、70.83%和64.06%，均高于对照组(62.5%)。400 Gy处理组的发芽率显著高于对照组和1 000、1 200 Gy处理组(P<0.05)，发芽率随着辐射剂量从400 Gy增加到1 200 Gy而逐渐降低。

2.2 60Co-γ射线辐射对金花菜幼苗生长的影响及半致死剂量(LD50)的确定

幼苗经过2个月的生长，不同辐射剂量的幼苗生长情况不同(图2)。观察发现，高剂量辐射的种子出现不发芽或部分种子发芽后真叶发育受到抑制的现象；高剂量辐射存活的植株矮小；辐射植株叶片出现花叶、复叶增加1～2片、叶片畸形的现象，但无明显规律。

对存活率的统计发现(表1)，对照组和2个低剂量组(400、600 Gy)的金花菜幼苗存活率分别为69.79%、69.27%和71.88%，高剂量组(800～1 200 Gy)的存活率分别是21.88%、20.31%、19.27%，低剂量组的幼苗存活率显著高于高剂量组。存活率和辐射剂量的线性回归方程为y=-0.0534x+80.992(R2=0.713)，将成活率50%代入方程，计算得出金花菜种子辐射的LD50为580 Gy。

幼苗株高的结果分析显示，各处理(0～1 200 Gy)幼苗平均株高分别为10.45、9.41、9.10、7.33、6.67、6.06 cm，对照组幼苗株高最高，对照组和低剂量组的幼苗株高显著高于高剂量组。

对分枝数的统计结果显示，对照组和400 Gy处理组的分枝数分别为4.50和5.30，高于其他处理，二者间无显著性差异，分枝数随着辐射剂量的增加而减少。

2.3 辐射剂量与生长指标相关性分析

相关性分析结果显示(表2)，辐射剂量与幼苗存活率、株高和分枝数均呈极显著负相关，相关性系数分别为-0.815、-0.704、-0.504。株高与分枝数和存活率存在显著正相关关系，相关性系数分别为0.416和0.805，发芽率与分枝数、存活率为正相关关系，相关性系数分别为0.323和0.338，但无显著性。

图2 不同辐射剂量对金花菜生长的影响(分枝期)Fig.2 Effect of different radiation doses on the growth of bur clover(branching period)

表1 60Co-γ辐射对金花菜幼苗生长影响Table 1 Effect of 60Co-γ radiation treatments on the seedling growth of bur clover

表2 相关性分析Table 2 Correlation analysis

2.4 60Co-γ射线辐射对金花菜开花和结荚的影响

金花菜多在秋季种植，一般在次年3月初开花，整个花期持续约40 d，边开花边结果，一般在植株距离地面1/3处荚果变黑时整株采收种子。

重复测量分析结果显示，时间和辐射剂量均对开花数量有显著性影响(P<0.05)，且时间和辐射剂量存在显著交互作用。由表3可知，除800 Gy处理组外，其他处理植株的开花数量均在第2次记录时(D7，即3月14日)达到最大值，0～1 200 Gy的开花数量分别达到484、548、587、287、568、493，D14后开花数量逐渐下降；到最后一次记录时(D42，即4月18日)，对照组、800 Gy、1 000 Gy和1 200 Gy处理组植株开花数量均为0，400 Gy和600 Gy处理组开花数量分别为46和94。400 Gy和600 Gy处理组金花菜开花数量在整个花期均高于对照，600 Gy处理组金花菜开花数量在第7～第28天为最高。

对结荚数量的重复测量分析结果显示，时间和辐射剂量对结荚数量影响显著(P<0.05)，且时间和辐射剂量存在显著交互作用。由表4可知，各处理结荚数量随着时间逐渐增加，D35时，0～1 200 Gy各处理的结荚数量分别达到为508、547、588、420、438、423，低剂量(0～600 Gy)结荚数量相对较高，但差异不显著；最后一次记录(D42)显示，400～800 Gy处理组结荚数量分别为577、648和485，对照组、1 000 Gy和1 200 Gy处理组荚果全部掉落，高剂量组植株比低剂量组提前一周枯黄。

表3 不同辐射剂量对金花菜开花数量的影响Table 3 Effect of different radiation treatments on flowers number of bur clover

表4 不同辐射剂量处理对金花菜结荚数量的影响Table 4 The effect of different radiation treatments on pods number of bur clover

3 讨论

辐射诱变选育新牧草品种能提高变异频率、加速育种过程、获得某些优良性状[15]，可以用于培育高产、优质、抗逆性强的草类植物新品种。低毒小冠花新品系、科辐系特早熟沙打旺(科辐一号、科辐二号、科辐六号)都是牧草辐射诱变育种取得的优良突变材料[16]，Tift-Eagle狗牙根和Tift-94狗牙根是草坪草辐射诱变育种的代表品种[17]，这些品种的推广应用效果良好，推动了草业相关育种研究的发展。

耿兴敏等[18]利用0～250 Gy的60Co-γ辐射不同品种的桂花种子，发现60Co-γ辐射剂量总体上与桂花种子发芽率呈负相关关系；李波等[19]利用600～1 800 Gy对苜蓿种子辐射，发现苜蓿种子的发芽率、发芽指数和发芽势均随辐射剂量的增加呈下降趋势。本试验中，辐射剂量和发芽率整体上为负相关关系，这与前人研究结果一致，但并未达到显著相关水平；与前人研究不同的是金花菜种子发芽率呈现出先升后降的规律，辐射处理的种子发芽率均高于对照，说明一定剂量范围的60Co-γ辐射能提高种子发芽率。

本研究结果显示，辐射剂量与幼苗存活率、株高、分枝数均为显著负相关。刘友接等[20]、李秀芬等[21]、刘春贵等[22]都认为低剂量辐射可以提高植物种子发芽率和存活率；Beyaz[23]研究发现低剂量辐射还可以提高幼苗对盐和干旱胁迫的耐受性，高剂量辐射抑制发芽，对植株生长不利。本研究结果与前人研究结果相一致，但剂量不同，Beyaz对箭筈豌豆的低辐射剂量界定在100 Gy以内，本研究金花菜的低剂量辐射在600 Gy以内。具体而言，400 Gy对金花菜幼苗存活率、株高和分枝数都有较好的促进作用，600 Gy对幼苗存活率和株高也有较好促进作用，超过600 Gy的辐射剂量降低了金花菜幼苗存成活率，导幼苗致植株矮小，分枝数减少，甚至出现真叶枯黄、植株死亡等现象，呈现显著的抑制作用，说明低剂量(≤600 Gy)辐射促进金花菜生长，而高剂量(>600 Gy)对金花菜生长的抑制作用明显。

前人关于水果和花卉育种应用的研究发现60Co-γ辐射会造成开花时间推迟、花色变化[24]，改变荚果形态、产量、颜色等性状[25]。本试验未发现花色、荚果形态和颜色的明显变化，但由金花菜开花数量和结荚数量的变化趋势可知，辐射对金花菜开花和结荚数量有影响，600 Gy的辐射量可提高开花、结荚数量，超过600 Gy的辐射量对开花和结荚的抑制作用明显。

60Co-γ射线可能抑制植株生长或引起植株死亡[26]，在诱变育种中，LD50是辐射适宜剂量选择的依据[27-28]，也是开展大量突变体诱变研究的基础[29]。不同植物之间、同一植株不同器官间，对60Co-γ辐射的耐受力和反应不同，LD50也不同。相关牧草辐射研究表明，无芒雀麦干种子LD50为100～150 Gy[30]，三叶草种子辐射的LD50为792 Gy[31]，高羊茅种子LD50为100～150 Gy，高羊茅分化苗的LD50为20～25 Gy[32]。本研究以幼苗存活率计算LD50，得到金花菜干种子的LD50为580 Gy，剂量率为2 Gy·min-1。

4 结论

本研究结果表明，60Co-γ辐射对金花菜种子的辐射效应明显。400 Gy辐射剂量可显著提高种子发芽率；当辐射剂量低于600 Gy时，辐射能促进金花菜种子萌发、生长和结实；当剂量高于600 Gy时，随着辐射剂量的增加，植株的生长和结实受到抑制。金花菜种子适宜的LD50为580 Gy，剂量率为2 Gy·min-1。