超高效液相色谱-三重四极杆质谱法同时测定 豆制品中12种碱性染料

林显活，吴正双，梁炽琼，罗瑞涟

（佛山市食品药品检验检测中心，广东佛山 528000）

近年来碱性染料被非法添加到食品中的事件已屡见不鲜，这些染料比食品添加剂中着色剂更容易染色，染色后颜色艳丽，不易褪色，且价格便宜，因此一些不法厂商将其违法使用在肉制品、豆制品、辣椒制品和火锅底料等食品中。这些碱性染料含有大量苯环及其衍生物，具有强致癌及潜在致癌性，我国已严禁将这些染料用于食品加工生产。

目前检测碱性染料的常用方法主要有高效液相色谱法[1-2]、高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法[3-5]和高效液相色谱-飞行时间串联质谱法[6-7]。由于食品种类繁多、基质复杂，高效液相色谱法容易出现干扰峰，化合物定性时可能会出现假阳性；高效液相色谱-飞行时间串联质谱法具有高通量快速筛的优势，但定量方面准确性不高。目前相关的研究主要集中在调味品和肉制品，豆制品作为工业化程度低、保质期相对较短的食品，尤其红豆腐乳及膨化豆制品更容易被非法添加这类物质。因此，建立一种能够同时测定豆制品中多种碱性染料的高通量方法十分必要。本研究对豆制品样品前处理方法、液相色谱条件和质谱条件进行了优化，开发了一种同时测定12种碱性染料的超高效液相色谱-串联质谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆腐、豆干、腐竹、红豆腐乳以及膨化豆制品，购自农贸市场和大型超市。

分散橙11、分散橙1、分散橙3、分散橙37、分散黄3、二甲基黄、二乙基黄、碱性橙22、碱性橙21、碱性嫩黄O、罗丹明B以及苏丹橙G标准品（纯度均≥90%），上海道垚测试技术有限公司；乙腈、甲醇、甲酸（均为色谱纯），上海安谱实验科技服务有限公司；HLB固相萃取柱（3 mL，60 mg）；阳离子交换固相萃取小柱（MCX，3 mL，60 mg）；C18固相萃取小柱（3 mL，200 mg），美国Waters公司；QuEChERS净化小管（填料为无水硫酸镁、PSA和C18混合物），美国安捷伦。

1.2 仪器与设备

SCIEX 5500超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪，美国SCIEX公司；LabTech MV5氮吹仪，北京莱伯泰科公司；高速冷冻离心机，德国SIGMA。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

准确称取12种标准品各1.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，均配制成100 μg/mL的单标储备液，置于-18 ℃冰箱中避光保存备用，根据需要用流动相逐级稀释成合适浓度的混合标准工作溶液备用。

1.3.2 样品提取

称取试样1～2 g（精确至0.01 g）至50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋1 min，超声提取20 min (超声过程中可不时振摇)，涡旋混匀，10000 r/min离心5 min，上清液转入另一干净的50 mL离心管中，重复提取一次，合并上清液，待净化，必要时用乙腈饱和的正己烷除油。

1.3.3 净化

依次用3 mL甲醇、3 mL水活化HLB固相萃取小柱，将上清液过柱，待其自然流尽后，依次用 2 mL水、2 mL甲醇+水（1+1）淋洗小柱并压干，最后用6 mL甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，流速控制在1 mL/min。洗脱液在50 ℃水浴下氮气吹干，准确加入1 mL甲醇+水（1+1）溶解残渣，涡旋1 min，经 0.2 μm有机相滤膜过滤，供UPLC-MS/MS上机分析。

1.3.4 液相色谱条件

色谱柱：WatersAcquity UPLC BEH C18（50 mm× 2.1 mm，1.7 μm）；柱温：35 ℃；进样体积：2 μL；流动相：0.1%的甲酸-水溶液（A）和乙腈（B）；流速：0.3 mL/min；梯度洗脱，洗脱程序：0～1.0 min， 70%A；1.0～5.5 min，70%A～5%A；5.5～6.0 min， 5%A；6.0～6.1 min，5%A～70%A；6.1～7.0 min， 70%A。

1.3.5 质谱条件

电离方式：电喷雾正离子（ESI+）模式；扫描方式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；离子化电压：5500 V；离子源温度：500 ℃；气帘气（Curtain Gas）：35 psi；雾化气（Gas1）：50 psi，辅助气（Gas2）：55 psi。

1.3.6 标准曲线绘制

按照优化后的仪器条件，用净化后的空白基质溶液配制12种碱性染料混合系列标准溶液经自动进样上机测定，以浓度（ng/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

配制浓度均为100 ng/mL的12种碱性染料的混合标准溶液，采用注射泵直接进样的方式，在正离子模式下先后找到各母离子和特征子离子，并对去簇电压和碰撞电压进行优化，得到最佳质谱参数，见表1。

表1 12种碱性染料的多反应监测（MRM）质谱参数

2.2 液相条件的优化

质谱电离方式为电喷雾正离子扫描（ESI+），流动相中添加带正电荷的离子如H+或NH4+等能够促进化合物的电离，进而增强灵敏度，故本文分别比较了甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-5 mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈 -5 mmol/L甲酸铵水溶液（含0.1%甲酸）流动相体系对12种碱性染料的分离效果和响应值的影响。结果表明，流动相体系中含有甲酸铵时，虽然部分化合物的响应值有明显增强，但大部分化合物的响应值下降明显，分离效果较差，且部分化合物的峰形也较差，见图1（a）。甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水分别为流动相时，乙腈的洗脱效果和峰形优于甲醇，目标物的响应值也较高，见图1（b）。

图1 不同流动相对12种碱性染料的多反应监测（MRM）色谱图的影响图

2.3 提取溶剂的选择

12种碱性染料的极性差别较大，但都能溶于水、甲醇、乙腈和乙醇等常用溶剂，选择一种合适的提取溶剂尤为重要。有标准和文献显示，罗丹明B用乙酸乙酯-环己烷或正己烷提取，经凝胶渗透色谱系统净化，实验浪费大量有机试剂，且检出限高，不能满足快速省时和高灵敏度的要求[8]；正己烷和丙酮对碱性染料的提取效率较差，回收率在40%以下。因此本实验采用水、甲醇、乙醇和乙腈作为提取溶剂，并比较了其提取效果，发现水的提取效果最差，尤其是对含油多的样品；甲醇和乙醇在提取出目标物质的同时也提取出更多的极性杂质和色素，不利于下一步的净化，也容易导致回收率下降；采用乙腈提取，净化后的样液较为干净，12种碱性染料的回收率也高。故本实验采用乙腈为提取溶剂。

2.4 净化条件的选择

豆制品如豆腐、油豆腐、腐竹、豆皮、豆干和腐乳等一般含有大量的脂肪、色素、蛋白质等大分子物质及其他杂质，经提取后，这些物质会随着目标物一并提取出来，对色谱柱、质谱仪离子源及四极杆质谱污染较大，因此很有必要对样品提取液进行净化。

如图2所示，强阳离子交换柱和C18固相萃取柱都有一定的净化效果，MCX固相萃取柱对少油型的火锅底料净化效果优于C18固相萃取柱；但对多油型的豆制品，C18固相萃取柱的净化效果优于MCX柱。HLB固相萃取柱的填料为N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物，是反相和阳离子交换的复合模式，对绝大部分样品的净化效果均比较好。商品化的QuEChERS净化小管使用方便，但是回收率比较低，净化效果不太理想。故本实验选用HLB固相萃取柱净化样品。

图2 固相萃取柱对12种碱性染料净化效率的影响

2.5 基质效应的影响

本实验采用腐竹、豆干、油豆腐实际空白样品，用净化后的样品溶液配制一定浓度的系列标准溶液，上机测试，绘制标准曲线得到斜率k1；然后用溶剂配制相同浓度的系列标准溶液上机测试，绘制标准曲线得到斜率k2，计算k1/k2的比值f，以反映净化前后基体对目标物的影响，比值f大于1为基质增强效应，小于1则为基质抑制效应。结果表明，经过萃取柱净化后，可显著降低多数染料的基体抑制 效应。

2.6 方法学验证

2.6.1 线性范围和检出限

12种碱性染料的线性范围、线性方程、相关系数和检出限见表2。本实验以空白样品添加低浓度标准溶液，使各化合物浓度水平均为0.2～0.5 μg/kg，按照1.3中的方法均平行测定10次，分别计算出10次测定结果的标准偏差，以标准偏差的3倍作检出限(置信水平P=95%)，得到各化合物的检出限。然后，按照1.3中的方法验证，结果显示，添加对应检出限浓度的样品，在UPLC-MS/MS上仍然有明显响应，且信噪比（S/N）均大于3。

表2 12种碱性染料的线性范围、线性方程、相关系数和检出限

2.6.2 回收率和精密度

按照实验测定步骤，采用腐竹、红豆腐乳两种具有代表性的豆制品作为研究对象，在空白样品中分别添加高（10 μg/kg）、中（5 μg/kg）、低（1 μg/kg）3个浓度进行加标回收实验，每个浓度平行测定6次，考察方法精密度。结果表明，在不同加标浓度条件下，不同的样品中，两种化合物的加标回收率为74.6%～93.5%，精密度（RSD）为4.9%～9.5%，能够满足日常检测工作的需要。

3 结论

本实验以豆制品类食品为研究对象，优化了前处理方法和液相色谱及质谱条件，考察了基质效应。采用乙腈提取样品，HLB固相萃取柱净化，UPLC-MS/MS法定性和定量。结果表明，该方法前处理过程简便、稳定可靠，回收率为74.6% ～93.5%，精密度（RSD）为4.9%～9.5%；检出限低，为0.1～0.5 μg/kg。 该方法适用于不同类别的豆制品的检测，可同时定性和定量测定其中的12种碱性染料，能够满足检验检测机构的日常检测工作要求，为豆制品的安全监测提供了有效的技术手段。