富含胶原蛋白肉制品中亚硝酸盐检测方法改进

2022-09-21唐文杰康绍英胡小军

食品安全导刊 2022年23期

张新，向俊，唐文杰，康绍英，胡小军

（1.食品安全监测与预警湖南省重点实验室，湖南长沙 410007；2.湖南省产商品质量检验研究院,湖南长沙 410007）

胶原蛋白为细胞外基质的重要成分，具有良好的延伸性能[1]，主要归结于其含有一个或者多个由α-链组成的三螺旋结构，同时还含有少量的葡萄糖和半乳糖。胶原蛋白在皮肤组织细胞中主要承担储水功能，保持皮肤的细嫩度，柔软度及弹性度的生理功能[2-4]。近几年，随着人们生活品质的提高和对健康的重视，富含胶原蛋白的肉制品越来越受到大家的青睐。在肉制品中加入亚硝酸盐可以起到护色及防腐作用，但亚硝酸盐可与血红蛋白结合，生成高铁血红蛋白，使红细胞运输氧的能力减弱，对人体造成危害，因此肉制品中亚硝酸盐含量是每年国家抽检的重点检测项目，成人亚硝酸盐中毒的剂量为0.3～0.5 g，亚硝酸盐摄入量超过3.0 g会产生严重的致死风险[5]。GB 2762—2017 规定，肉制品中亚硝酸盐的限量值为30 mg/kg。有研究表明，长期过量食用富含亚硝酸盐的食品可能诱发高铁血红蛋白症，同时还会增加患癌症风险[6-9]。

目前亚硝酸盐的检测国家标准为GB 5009.33—2016，标准规定，样品进行前处理时需要进行加热，此时富含胶原蛋白的肉制品往往会出现溶液混浊、难以过滤、实验回收率低等现象。因此，很有必要对该类产品亚硝酸盐的测定方法进行改进。邵明华[10]通过先定性筛选，再定量检测的方法对国标法进行了改进，能一定程度上减少检验时间，提高检验员工作效率，但是该方法容易出现假阳性的现象，导致漏检事故发生；同时样品本身颜色较深时对定性结果也存在一定干扰。木瓜蛋白酶属于一种半胱氨酸蛋白水解酶，具有良好的稳定性和很强的蛋白水解能力，可以从番木瓜及其根茎中提取得到。它可以通过切割氨基酸的肽键的方式改变蛋白质的结构，对蛋白质进行水解，从而有效降低蛋白质的分子量[11-14]。本方法利用木瓜蛋白酶对胶原蛋白良好的分解作用，对胶原蛋白进行分解处理，从而有效解决该类产品亚硝酸盐测定过程中存在的难题。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

5种富含胶原蛋白的不同食品：样A为香辣猪脚；样B为卤鸡爪；样C为腊猪脸；样D为卤鸭掌；样E为五香猪皮，以上样品均为市场上购买。

木瓜蛋白酶（酶活力≥3700 U/g）、硼酸钠、亚铁氰化钾、盐酸、盐酸萘乙二胺、对氨基苯磺酸、乙酸锌和亚硝酸盐标准液。所用试剂均为分析纯，所用水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

万分之一电子分析天平，奥豪斯仪器有限公司；DZKW-4电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；紫外可见光分光光度计（T9CS），北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

准确称取5 g均匀试样于锥形瓶中，再加入0.1 g木瓜蛋白酶，同时加12.5 mL 50 g/L饱和硼砂溶液，加入大约150 mL、70 ℃左右的超纯水，手动摇匀后放置沸水浴中加热15 min。取出冷却至室温，将样液全部转移到200 mL容量瓶中，分别加入5 mL 106 g/L亚铁氰化钾溶液和5 mL 220 g/L乙酸锌溶液，最后用超纯水定容。静置30 min后用滤纸过滤，初滤液30 mL弃去不用，后面滤液备用。同时按照 GB 5009.33—2016准确称取5 g均匀试样于锥形瓶中，加12.5 mL 50 g/L饱和硼砂溶液，加大约150 mL、 70 ℃左右的超纯水，混匀，于沸水中加热15 min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。定量转移上述提取液至200 mL容量瓶中，加入5 mL 106 g/L亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5 mL 220 g/L乙酸锌溶液。加水至刻度，摇匀，放置30 min后用滤纸过滤，弃去初滤液30 mL，滤液备用。相较于国标法，本法前处理加入了木瓜蛋白酶对样品中胶原蛋白进行酶解。

1.3.2 亚硝酸盐的测定

于50 mL具塞比色管中准确吸取40.0 mL前处理好的滤液，同时另外准确吸取相当于0 μg、1.0 μg、 2.0 μg、3.0 μg、4.0 μg、5.0 μg、7.5 μg、10.0 μg和12.5 μg的亚硝酸钠标准使用液，分别置于50 mL具塞比色管中。将2 mL 4 g/L对氨基苯磺酸溶液分别加入标准管与试样管中，混匀，静置5 min后各加入1 mL 2 g/L盐酸萘乙二胺溶液。定容摇匀，静置 15 min。在波长538 nm处用1 cm比色杯测量标准液和样液的吸光度，通过绘制标准曲线比较得到样液浓度。同时做试剂空白。

2 结果与分析

2.1 本方法与国标法前处理样液吸光度对比

对样A、样B、样C、样D和样E分别按国标GB 5009.33—2016和本方法进行前处理。将处理的样液于波长538 nm处测吸光度，所测结果如表1所示。本方法处理的样液吸光度明显小于国标法处理的样液，国标法处理的样液混浊，而本方法处理的样液明显澄清透明，其原因在于富含胶原蛋白样品受热再冷却溶液发生团聚，造成样液混浊，从而导致吸光度偏高，给后期亚硝酸盐的测定造成偏高的影响。而本方法加入木瓜蛋白酶后胶原蛋白被酶解，样液变得澄清，便于样液亚硝酸盐的测定，有利于实验准确度的提高。

表1 本方法与国标法前处理样液吸光度比较

2.2 本方法与国标法加标回收率对比

分别称取5 g样A、样B、样C、样D和样E，同时用本方法和国标法分别加入方法测定低限（1 mg/kg）、2倍方法测定低限、10倍方法测定低限的亚硝酸钠标准物质，进行加标回收实验，做6次平行实验，取平均值，其结果见表2。

由表2可知，本方法加标回收率在93.6%～97.8%，具有良好的准确度。同时，本方法回收率明显较国标法好，其原因在于国标法前处理时富含胶原蛋白的样品会出现团聚包覆，不利于亚硝酸盐的有效提取，造成加标回收率明显偏低。本方法通过加入木瓜蛋白酶对样品进行酶解，避免了团聚的发生，使得样品澄清透明，便于提取，回收率及准确度得到有效提升。