三聚氰胺前处理优化的检测方法

钱成林，吴 思，郑旭涛，董成虎，陈权翠*

（1.新希望乳业股份有限公司食品安全监管部，四川成都 610000； 2.华测检测认证集团股份有限公司（云南华测检测认证有限公司），云南昆明 650000）

三聚氰胺（C3H6N6），俗称密胺、蛋白精，IUPAC命名为1,3,5-三嗪-2,4,6-三氨基，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料。它是白色单斜晶体，几乎无味，微溶于水（3.1 g/L常温），可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油及吡啶等，不溶于丙酮、醚类，对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。临床研究发现，三聚氰胺可能会在人体泌尿系统如膀胱和肾脏形成泥沙样结晶或 结石[1]。

中国国家食品质量监督检测中心在2008年9月13日指出，三聚氰胺属于化工原料，不允许添加到食品中，故暂未设定像农药般的残留标准限制。除了人为添加外，三聚氰胺类物质还可能从环境、食品包装材料等途径进入到食品，且其含量极低。由于动物源食品基质背景复杂、所需前处理过程烦琐费时，因此开发复杂食品基质中痕量三聚氰胺类物质快速、高灵敏分析检测方法对保障我国食品安全具有重要的意义[2]。2008年10月8日，原卫生部、工业和信息化部、农业部、国家工商行政管理总局和国家质量监督检验检疫总局联合发布公告，制定三聚氰胺在乳与乳制品中的临时管理值。

婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1 mg/kg， 高于1 mg/kg的产品一律不得销售。液态奶（包括原料乳）、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为 2.5 mg/kg，高于2.5 mg/kg的产品一律不得销售。目前使用的检测方法有GB/T 22388—2008原料乳及乳制品中三聚氰胺检测第一法高效液相色谱法[3]和 GB/T 22400—2008原料乳中三聚氰胺检测方法[4]，按照检测方法检测结果有所偏低，方法检出限为2.0 mg/kg，加标浓度为2～10 mg/kg，回收率在80%～110%，不能满足《合格评定 化学分析方法确认和认证指南》（GB/T 27417—2017）关于加标回收率的要求，在目前的方法上进行改进，检测结果更加准确可靠。加标回收率都在90%～110%，满足要求[5]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛奶样品，工厂奶罐检测合格牛奶；乙腈（色谱纯，生产批号：148405，德国默克）；柠檬酸（分析纯，生产批号：20140201，重庆川东化工有限公司）；辛烷磺酸钠（分析纯，生产批号：20160602，国药集团化学试剂有限公司）；三氯乙酸（分析纯，生产批号：20130124，广东光华科技股份有限公司）；甲醇（色谱纯，生产批号：1847607，德国默克）；超纯水，实验室自制。

离子对缓冲试剂：使用ME204E电子天平准确称取2.10 g柠檬酸和2.16 g辛烷磺酸钠，加入约980 mL 超纯水，调节pH值至3.0，用水定容至1000 mL。使用0.45 μm水相滤膜过滤后进行使用。

1.2 仪器与设备

安捷伦高效液相色谱仪1260（美国Aligent，紫外检测器VWD，检测波长240 nm，检测温度40 ℃）；ME204E电子天平，精确度0.0001 g，梅特勒托利多。

1.3 实验方法

1.3.1 操作步骤

使用1000 mg/L的标准品进行加标至1.25 mg/L、 2.50 mg/L、10.00 mg/L。分别18次准确称取（2.000± 0.010）g制备好的加标样品至50 mL离心管中，准确移取18 mL浓度为2%的三氯乙酸溶液和5 mL乙腈溶液至每只离心管中，涡旋混匀1 min，超声提取10 min，振荡提10 min，6000 r/min离心10 min。 用滤纸进行过滤后作为净化液，过滤溶液时间从 30 min，缩短到5 min左右。再用3 mL甲醇和5 mL水先后过活化好的阳离子交换柱，将净化液5 mL加5 mL水混匀后过柱，继续用3 mL水和3 mL甲醇先后过柱，加入6 mL 5%氨化甲醇溶液洗脱，将洗脱液置于50 ℃氮吹至干，取出比色管加入1 mL流动相溶液用0.45 μm滤膜过滤到进样瓶中。没有加标的样品依据上述方法进行检测。

1.3.2 进样条件

色谱柱C18（150 mm×4.6 mm×5 μm）；波长：紫外240 nm；柱温：40 ℃；进样体积：20 μL；流速：1 mL/min；洗脱方式：等度洗脱。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

依据标准曲线浓度及峰面积结果，绘制标准曲线，线性关系y=ax+b，其中a=82.355，b=-3.1957， 线性相关系数R2=0.9997，可以满足≥0.999以上的要求，具体见图1。

图1 标准曲线线性关系

2.2 加标回收率

依据回收率标准要求（表1），分别加标至 1.25 mg/L、2.50 mg/L、10.00 mg/L，并进行平行测定6次，加标回收率在95.1%～108.4%，其中加标至1.25 mg/L的样品加标回收率在98.5%～108.4%，加标浓度至2.50 mg/L的样品加标回收率为98.8%～ 100.9%，加标浓度至10.00 mg/L的样品加标回收率在95.1%～98.5%，都能满足加标回收率在90%～110%的要求。加标回收率见表2。

表1 加标回收率标准要求

表2 加标回收率结果表（n=6）

2.3 精密度

计算1.25 mg/L、2.50 mg/L、10.00 mg/L的加标检测结果，RSD值都低于5%，满足RSD的要求，见 表3。

表3 样品精密度

2.4 方法检出限和定量限

按照标准方法进行加标实验，查看安捷伦1260高效液相色谱仪18次检测结果的信噪比，3倍的信噪比作为方法检出限，10倍的信噪比作为方法定量限。由于检测18个检测结果计算的方法检出限和定量限都不一致，采用18次计算结果的平均值作为方法检出限和定量限。方法检出限为0.08 mg/L，方法定量限为0.28 mg/L，见表4。

表4 方法检出限与定量限（单位：mg/L）

2.5 优化方法与国标方法对比

优化方法与国标方法对比结果见表5，优化方法检出限更低，定容时间短，加标回收率符合要求。

表5 优化方法与国标方法对比情况

3 结论

结果表明，更改前处理方法后，过滤定容时间从原来30 min缩短至5 min，定容时间缩短至原来的1/6；加标回收率有明显改善，从80%～110%上升至95.1%～108.4%，改善比较明显，检测准确性提高；精密度实验方面，加标样品检测偏差RSD值在5%以内；方法检出限为0.08 mg/kg，方法定量限为 0.28 mg/kg，与原有标准的定量限2.0 mg/kg相比降低显著，低浓度样品更加容易检出。所以更改定容方式后检测结果更加高效、准确、可靠。