苦荞酒中总黄酮含量的测定

安 军

（海南椰岛酒业发展有限公司，海南海口 570100）

苦荞麦具有较高的营养价值，含有蛋白质、生物类黄酮、多种维生素、纤维素和18种氨基酸等多种成分。此外，它还是一味药用价值较高的中药。现代医学研究表明，苦荞麦具有降血糖、降血脂、抗疲劳和增强免疫的功能，这都与其中所含的黄酮类化合物有关[1]。本文通过方法学相关系列实验，采用分光光度法对苦荞酒中的总黄酮含量进行检测，为苦荞酒中总黄酮的相关研究提供参考[2]。

1 材料与方法

1.1 仪器

电子天平XS205（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；紫外-可见分光光度计TU-1810（北京普析通用仪器有限责任公司）；超纯水机MUL-9000（B）-1-10（南京总馨纯水设备有限公司）；移液枪（200 µL、1000 µL、5 mL，上海宝予德科学仪器有限公司）；涡旋混匀仪ZX4（意大利VELP）； 超声波清洗器KQ-300VDB（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 溶液配制

①40%乙醇溶液。量取40 mL无水乙醇，定容至100 mL，混匀。②5%亚硝酸钠溶液。称取5.0 g亚硝酸钠，用水溶解，定容至100 mL，混匀。③10%硝酸铝溶液。称取10.0 g硝酸铝，用水溶解，定容至100 mL，混匀。④4%氢氧化钠溶液。称取4.0 g氢氧化钠，用水溶解，定容至100 mL，混匀。⑤200 mg/L 芦丁标准溶液。准确称取10.0 mg芦丁标准品至 50 mL容量瓶中，加入40%乙醇溶液充分溶解后，定容、混匀。本方法中的水为GB/T 6682—2008规定的一级水。

1.3 测定方法

1.3.1 检测波长的选择

准确称量芦丁标准物质11.13 mg（100080-201811， 92.4%，中国食品药品检定研究院）于50 mL容量瓶中，用40%乙醇定容并摇匀。吸取芦丁标准溶液1.0 mL置于10 mL具塞比色管中，加入0.3 mL5%亚硝酸钠溶液并摇匀，静置6 min，再加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6 min，加入4 mL 4%氢氧化钠溶液，充分摇匀，用40%乙醇定容至刻度，摇匀静置12 min，在波长400～600 nm下进行扫描，确定最佳吸收波长。

1.3.2 工作标准曲线的绘制

精确吸取芦丁标准溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、 0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL，分别置于10 mL具塞比色管中，分别添加40%乙醇至1 mL，加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液并摇匀，静置6 min，再加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6 min，加入4 mL 4%氢氧化钠溶液，充分摇匀，用40%乙醇定容至刻度，摇匀静置12 min。于波长510 nm处测定吸光度值，同时以40%乙醇为空白测定吸光度。以吸光度为纵坐标，芦丁质量为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.3 样品的测定

准确吸取苦荞酒样品1.0 mL，置于10 mL比色管中，按照1.3.2中的方法，于波长510 nm处测定其吸光度值，并根据标准曲线计算出总黄酮含量。

1.3.4 总黄酮含量的计算

总黄酮含量的计算公式为

式中：C为苦荞酒中总黄酮的含量，µg/mL；A为样品吸光度；X为标准曲线截距；B为标准曲线斜率。

2 结果与分析

2.1 波长的确定

取芦丁标准溶液1.0 mL，置于10 mL比色管中，按照1.3.2中的方法操作，最后摇匀静置12 min。以试剂空白为参比，于400～600 nm波长下测定吸收曲线。结果表明芦丁标准溶液在510 nm处有最大吸收，因此选择510 nm作为测定波长。

2.2 显色条件的优化

2.2.1 总黄酮在不同溶剂中吸收情况

取芦丁标准溶液各1.0 mL于3个10 mL比色管中，按照1.3.2中的方法，最后摇匀静置12 min。以试剂空白为参比，于波长510 nm处测定其吸光度值，详见表1。结果表明，在相同实验条件下总黄酮在40%乙醇溶剂中吸光度最大。

表1 不同试剂的吸光度情况

2.2.2 显色剂硝酸铝浓度的选择

取芦丁标准溶液各1.0 mL于5个10 mL比色管中，按照1.3.2中的方法，加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液并摇匀，静置6 min，再加入不同质量浓度（2%、5%、10%、15%和20%）硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，加4 mL 4%氢氧化钠溶液，充分摇匀，用40%乙醇定容至刻度，摇匀静置12 min。以试剂空白为参比，于波长510 nm处测定其吸光度值，结果见表2。随着硝酸铝浓度的增加，吸光度快速增加，在浓度为10%时达到最大值，此后再增加浓度，吸光度值缓慢下降，因此选择硝酸铝浓度 为10%。

表2 不同硝酸铝浓度吸光度情况

2.2.3 显色剂硝酸铝用量的选择

取芦丁标准溶液各1.0 mL于5个10 mL比色管中，按照1.3.2中的方法，加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液并摇匀，静置6 min，再加入不同体积（0.1 mL、 0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL）10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6 min，加4 mL 4%氢氧化钠溶液，充分摇匀，用40%乙醇定容至刻度，摇匀静置12 min。以试剂空白为参比，于波长510 nm处测定其吸光度值。如表3所示，随着硝酸铝使用量的增加，吸光度值迅速增大，在加入量0.3 mL时到达最大值，此后再增大加入量，吸光度呈现下降趋势并逐渐趋于稳定，因此选择硝酸铝用量为0.3 mL。

表3 不同硝酸铝用量吸光度情况

2.3 工作标准曲线及线性范围

按照1.3.2中的方法，得到回归方程：Y=0.00133X+ 0.00121，其中斜率a=0.00133，截距b=0.00121，相关系数R=0.9999。由试验结果可知，芦丁在0～ 205.682 µg呈良好的线性关系，详见表4。

表4 标准含量系列与相应的吸光度

2.4 检出限与测定下限

根据《环境监测分析方法标准制订技术导则》（HJ 168—2020）[3]的技术要求，结合回归方程Y=0.00133X+0.00121，可计算出检出限为7.5 µg，测定下限为30 µg。

2.5 精密度

选取两种苦荞酒样品，每份各1.0 mL，按照1.3.2中的方法连续测定6次，详见表5。结果显示RSD值为3.54%，说明该方法精密度高。实验过程中，发现两种苦荞酒经显色剂显色后，其络合物颜色分别为淡红色和橙黄色。

表5 精密度实验测定结果

2.6 稳定性

取苦荞酒样品1.0 mL，按照1.3.2中的方法将样品制备完成后，于不同时间测其吸光度，观察2 h内吸光度变化趋势（见表6）。结果表明，该方法在2 h内稳定性良好。

表6 稳定性试验

2.7 重复性

由两名实验人员取两种苦荞酒样品，每种6份各1.0 mL，按照1.3.2中的方法测定吸光度，并根据标准曲线计算出总黄酮含量（见表7）。结果表明，该方法重复性较好。

表7 样品重复性试验

2.8 加标回收率

取两种苦荞酒样品，按照1.3.2中的方法进行加标回收率检测，平行测定3次。实验结果表明，该方法的回收率为88.88%～98.28%，满足分析要求（见表8）。

表8 样品回收率试验

3 讨论与结论

实验过程中发现，芦丁标准溶液、苦荞酒经显色剂显色后，其络合物颜色分别为淡红色和橙黄色，是由于黄酮类化合物泛指这种两个苯环通过中央三碳链相互连接而成的一系列化合物，而黄酮类化合物的颜色根据中间吡喃环的不同氧化水平和两侧A、B环上连接的各种取代基而分为不同的黄酮类型[4-5]。只有物质中含有邻二酚羟基，并且邻二酚羟基没有取代基时，该法才在510 nm处有最大吸收。通过上述实验可以得出，该方法能快速准确地检测苦荞酒中总黄酮的含量，操作简单，其精密度、重复性和加标回收率等各项指标均符合相关标准的分析检测要求，结果准确可靠。