一株罕见的萨奥沙门氏菌的分离鉴定

李海遥

（江阳区疾病预防控制中心，四川泸州 646000）

四川省泸州市江阳区位于四川省东南端，全区面积600多平方公里，常住人口70余万人，属亚热带湿润性季风气候，气温适宜各种微生物生长，食物中毒时有发生，又尤其以夏秋季节为高发。食物中毒分化学性食物中毒和细菌性食物中毒，江阳区化学性食物中毒以食用亚硝酸盐和化儿草中毒为主，细菌性食物中毒发生过由沙门氏菌、肉毒梭菌、副溶血性弧菌引起的食物中毒，其中又以沙门氏菌引起的食物中毒最常见。本次分离出的萨奥沙门氏菌源于一次疑似食物中毒事件的致病菌分离，江阳区疾病预防控制中心接到市民投诉后，采集了餐厅剩余食品、食品加工工具和相关食客、餐厅员工的大便或肛拭子标本，所有样本经过实验室致病菌分离培养、鉴定，除餐厅厨师肛拭子检出萨奥沙门氏菌外，其余均未检出相关致病菌。现将萨奥沙门氏菌分离鉴定过程详述如下。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

BHC-1300IIA/B3生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）、LS-75HD立式压力蒸汽灭菌器（江阴滨江医疗设备有限公司）、YP802N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、SPX-330低温培养箱（常州恒隆仪器有限公司）、SPX-205-III生化培养箱（常州恒隆仪器有限公司）及XH-B漩涡混匀器（江苏康健医疗用品有限公司）。

缓冲蛋白胨水（BPW）、亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）、四硫磺酸盐煌绿增菌液基础（TTB）、SS琼脂、亚硫酸铋琼脂（BS）、沙门氏菌显色培养基（第二代）、三糖铁琼脂（TSI）、营养琼脂（NA）、脑心浸出液（BHI）及博检革兰氏阴性细菌鉴定系统，均购于青岛海博生物技术有限公司，沙门氏菌属60种诊断血清购于宁波天润生物药业有限公司。

1.2 样本采集

因其他样本未检出相关致病菌，在此不再详述。肛拭子采集：将无菌棉签插入被采集人直肠5 cm左右，旋转360°取出放入10 mL生理盐水管备用[1]。

1.3 分离鉴定方法

1.3.1 增菌培养

将含肛拭子的生理盐水管漩涡混匀，分别吸取 1 mL混匀液接种到10 mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）和10 mL四硫磺酸盐煌绿增菌液（TTB）中，接种后的亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）于36 ℃培养24 h， 四硫磺酸盐煌绿增菌液（TTB）于42 ℃培养24 h[2]。

1.3.2 分离培养

将培养后的亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）和四硫磺酸盐煌绿增菌液（TTB）分别划线接种亚硫酸铋琼脂（BS）平板、沙门氏菌显色平板和SS琼脂平板，亚硫酸铋琼脂（BS）平板于36 ℃培养48 h，沙门氏菌显色平板和SS琼脂平板于36 ℃培养24 h。将可疑菌落接种三糖铁琼脂管，同时接种营养琼脂平板纯培养，于36 ℃培养24 h。

1.3.3 生化鉴定

将营养琼脂平板上的菌落染色镜检，确定为革兰阴性菌，将剩余菌落挑至无菌生理盐水管中制成适当浓度菌悬液，接种博检革兰氏阴性细菌鉴定系统，于36 ℃培养24 h。

1.3.4 血清型鉴定

挑取适量营养琼脂平板上的菌落与生理盐水研开混匀，排除自凝后，用沙门氏多价O血清凝集，凝集后，再分别用单价和复合O血清凝集，因宁波天润沙门氏菌属60种诊断血清未包含O1血清，所以O1血清凝集未做，再用对应H血清凝集。

2 结果与分析

根据血清凝集结果，查阅沙门氏菌属抗原表，得知其为E4群沙门氏菌中的萨奥沙门氏菌。

2.1 菌落形态鉴定结果

经培养后，从亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）转种的平板发现可疑沙门氏菌菌落，在亚硫酸铋琼脂（BS）平板上为棕褐色菌落，菌落周围培养基呈棕色；在沙门氏菌显色平板上为紫色菌落；在SS琼脂平板上为中心黑色、边缘透明、直径2 mm左右的菌落，菌落图片见图1。可疑菌落接种培养后三糖铁斜面呈红色，底层黄色，产气，产硫化氢，三糖铁琼脂管结果见图2。

图1 在SS琼脂平板上的菌落形态图

图2 在三糖铁琼脂管上的生长反应图

2.2 生化鉴定结果

按1.3.3步骤操作，培养后读取结果如表1所示。

表1 可疑典型沙门氏菌生化鉴定结果

2.3 血清型鉴定结果

按1.3.4步骤操作，凝集后确定血清型为e:3，19、h、n、z15。

3 结论

此次菌株分离在标准方法上加用了SS琼脂平板，此种平板历来在江阳区疾病预防控制中心分离沙门氏菌和志贺氏菌中使用，培养基价格便宜，易于配制，且沙门氏菌和志贺氏菌在SS琼脂平板上菌落典型，易于观察，建议有条件的实验室加用。另外，疾控中心外出采样人员，可以随身携带SS平板，以方便采样后立即划线接种平板，接种后的平板带回实验室后需立即放入培养箱中培养，培养24 h后便可初步了解沙门氏菌和志贺氏菌感染情况，若有可疑菌落生长，即可进行纯培养和后续生化鉴定及血清学凝集试验，这就大大提前了国标方法上的沙门氏菌和志贺氏菌的检出时间[3]。当然，因食物中毒事件比较特殊，需要快速找出致病因子，因此此法可作为食物中毒事件中沙门氏菌和志贺氏菌分离培养的快速筛查方法，但在此法进行的同时，国标方法需同步进行，以便对快速分离出的致病菌进行印证。

沙门氏菌血清凝集试验较烦琐，特别是双相菌只检出其中一相鞭毛抗原，另一相经常需要诱导才能凝出结果。诱导方法较多，如国标方法、改良半固体RV培养基诱导法[4]等。江阳区疾病预防控制中心实验室参考国标方法，常用的诱导方法如下：取营养琼脂和脑心浸出液（BHI）各一半用蒸馏水配制成混合物，经高压灭菌后倾倒成平板，放培养箱里孵干表面水分，在平板上滴几小滴已经凝出的第一相血清，用接种环挑取少量需诱导的菌落接种在血清中心，盖上平板放培养箱中36 ℃培养18～24 h，培养后挑取蔓延生长的菌苔边缘做另一相血清凝集，若仍不能诱导出鞭毛抗原，则继续取菌苔边缘菌落重复实验，一般两次即可诱导出另一相鞭毛抗原。若此法2～3次均不能诱导出第二相鞭毛抗原，则需更换诱导方法，以防菌落变为粗糙型菌落出现假凝集。另一种位相变异方法所用培养基为Swarm琼脂，此琼脂专用于沙门氏菌H相抗原诱导试验，此方法与上一方法比较大同小异，但是此法可用制动试验印证诱导实验结果，较上一方法更准确。

沙门氏菌为江阳区常见的食物中毒病原体，因此在预防方面尤其重要。本次接报的食物中毒事件虽然厨师肛拭子检出萨奥沙门氏菌，但餐厅剩余食物、餐厅食品加工工具以及有疑似食物中毒症状的所有食客均未检出病原菌，因此没有充分的证据判定此次事件为食物中毒事件[5]。当然，江阳区疾病预防控制中心本次肛拭子采样是把采样后的拭子放入10 mL无菌生理盐水管中，生理盐水对样本存在稀释可能，为避免这种情况，采样尽可能采集大便样本，或采集后的肛拭子直接放入相应增菌液中进入检测程序。本次事件中，厨师无发热、腹泻、呕吐等沙门氏菌感染引起的症状，经查阅文献，发现1984年河北省石家庄市卫生防疫站在饮食行业健康人员便检普查中曾分离出过此种沙门氏菌[6]，因此健康人群携带萨奥沙门氏菌是否发病、是否会传染他人还有待研究。目前，国家对从业人员的健康监控政策是每年进行一次预防性健康检查，体检项目中包含大便或肛拭子中沙门氏菌的检测，这就杜绝了携带沙门氏菌而不发病人员从事食品相关工作而传染他人。对于承担健康体检工作的医疗机构来说，就尤其要注意此类型标本的检测，以防漏检造成大面积的传播。