肌电相同的喉内外肌乙酰胆碱及组织结构的比较Δ

朱明婧 徐志文 徐诚

1 广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科(南宁 530021)； 2 柳州市科技大学第二附属医院耳鼻喉头颈外科

喉内肌可以协调声带运动，使声带产生内收、外展及紧张等精确变化[1，2]。环杓后肌是声带唯一的外展肌，环杓侧肌是声带内收运动的最主要的肌肉，本课题组前期完成了舌骨上下肌群与喉内肌的同步电生理实验，发现下颌舌骨肌、甲状舌骨肌与环杓侧肌肌电相似，而颏舌骨肌、胸骨甲状肌与环杓后肌肌电相似[3，4]。 乙酰胆碱(Ach)是神经元与效应器如肌肉细胞之间传递信息的化学物质，运动的产生要由突触前膜释放乙酰胆碱，与突触后膜的乙酰胆碱受体(nAChR)及运动终板(MEP)结合，触发下一级的Na+-K+-ATP酶系列[5]。肌纤维的类型决定其功能，慢肌纤维(myosin heavy chain Ⅰ，MHC-Ⅰ)的能量来源主要靠有氧氧化，收缩力较弱且缓慢，但不易疲劳；快肌纤维(myosin heavy chain Ⅱ,MHC-Ⅱ)能量来源主要靠无氧酵解，收缩快，但持续时间短[6]。本研究将在肌电类同的基础上进一步探讨相应喉内、外肌肉的Ach、nAChR和Na+-K+-ATP酶的浓度、MEP水平、肌纤维类型构成方面的异同点，为下一步精准选择相应喉外肌支配神经进行神经移植或神经肌蒂移植治疗声带麻痹提供参考。

1 材料和方法

1.1实验动物 10只健康成年犬(雌雄不拘)购买自广西医科大学动物实验中心，所有实验研究均已取得广西医科大学医学伦理委员会批准。

速眠新Ⅱ联合戊巴比妥钠联合麻醉犬后，取双侧颏舌骨肌、胸骨甲状肌与环杓后肌做比较，取下颌舌骨肌、甲状舌骨肌与环杓侧肌作比较，均取神经入肌点肌肉。一部分置于-80℃冰箱保存，一部分置于4%多聚甲醛中保存。

1.2ELISA法检测各肌肉Ach、AChR、Na+-K+-ATP酶浓度 取神经入肌点组织块1 g，加入9 ml的PBS溶液，使用组织匀浆机进行碎裂，并离心取上清液(4 ℃，8 000 rpm,10 min)，用ELISA试剂盒设置3个复孔测量待测样品的蛋白浓度；15 min内使用酶标仪在450 nm处读取光密度值(OD值)。使用EXCEL表根据标准曲线的直线回归方程计算浓度。再乘以稀释倍数(45 x)，即为待测样品的浓度。

1.3乙酰胆碱酯酶染色观察各肌肉中运动终板的数量 Karnovsky-Roots亚铁氰化铜法显示运动终板。取神经入肌点0.3 cm处新鲜肌肉组织，固定于4%多聚甲醛中，制作成8微米厚度冰冻切片，置于Karnovsky-Roots孵育液中2 h至切片呈红棕色。每组随机取5张切片先在100倍低倍镜下确定目标，并换至200倍镜下计数各组动物每张切片AchE反应阳性的MEP，换至400倍高倍镜照相，每张切片至少记录4个视野中的MEP个数。

1.4ATP酶染色观察各肌纤维中MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ个数及横截面积 ATP酶染色显示MHC-Ⅰ型(灰色)、MHC-Ⅱ型(黑色)肌纤维，取目标肌肉后将标本储存于-80 ℃冰箱内，取横截面制作成8微米厚冰冻切片，进行碱性ATP酶染色，在Image Pro 6.0图像分析软件下，随机选取5个视野(200x)，记录Ⅰ型(灰色)Ⅱ型(黑色)肌纤维个数及面积，MHC-II/MHC-I个数比及横截面积比。

1.5荧光定量PCR检测nAChR、MHC-Ⅰ、MHC-ⅡmRNA的表达 用Trizol提取各肌肉组织的总RNA，采用逆转录试剂盒步骤，反转录后得到cDNA，与各类相关引物进行PCR反应，以GAPDH作为内参，检测各组肌肉基因以及内参表达量，反应条件：预变性95 ℃，10 min，变性95 ℃，10 s,退火60 ℃，30 s，40个循环。结果用2-△△Ct进行相对定量分析。

1.6统计学方法 运用SPSS 20.0统计软件分析数据，符合正态分布的资料采用单因素方差分析，非正态分布的资料采用非参数检验进行比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各肌肉Ach、AChR、Na+-K+-ATP酶的浓度 各肌肉Ach、AChR、Na+-K+-ATP酶浓度见表1，可见下颌舌骨肌的Ach浓度低于环杓侧肌(P<0.05)，Na+-K+-ATP酶浓度高于环杓侧肌(P<0.05)，nAChR浓度差异无统计示意义(P>0.05)；甲状舌骨肌Ach、Na+-K+-ATP酶和nAChR浓度与环杓侧肌差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。胸骨甲状肌的Ach浓度低于环杓后肌(P<0.05)，Na+-K+-ATP酶浓度高于环杓后肌(P<0.05)，nAChR浓度差异无统计意义(P>0.05)；颏舌骨肌Ach浓度、Na+-K+-ATP酶、nAChR浓度与环杓后肌均差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 各肌肉中Ach、nAChR、Na+-K+-ATP酶浓度

2.2各肌肉中运动终板的数量 Karnovsky-Roots亚铁氰化铜法镜下观MEP呈棕褐色椭圆或圆形结构附于肌纤维表面，各肌肉MEP计数结果为：下颌舌骨肌8.75±1.04个/视野，甲状舌骨肌8.50±1.41个/视野，环杓侧肌9.37±1.06个/视野，颏舌骨肌7.13±0.83个/视野，胸骨甲状肌7.5±1.07个/视野，环杓后肌7±1.07个/视野,下颌舌骨肌、甲状舌骨肌与环杓侧肌之间，颏舌骨肌、胸骨甲状肌与环杓后肌之间的运动终板数量比较差异均无统计学意义(P>0.05)(图1)。

2.3ATP酶染色观察各肌肉的肌纤维中MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ个数及横截面积的结果 各肌肉的肌纤维中MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ个数及横截面积的结果见表2,可见下颌舌骨肌和甲状舌骨肌的MHC-Ⅱ/MHC-Ⅰ的个数比与环杓侧肌相比差异均无统计学意义(P>0.05)，下颌舌骨肌和甲状舌骨肌的MHC-Ⅱ与MHC-Ⅰ的横截面积比与环杓侧肌相比有显著性差异(P<0.05)，颏舌骨肌的MHC-Ⅱ/MHC-Ⅰ个数比和MHC-Ⅱ与MHC-Ⅰ横截面积比与环杓后肌相比均有显著性差异(P<0.05)，胸骨甲状肌的MHC-Ⅱ/MHC-Ⅰ个数比与环杓后肌相比无显著差异(均P>0.05)，但MHC-Ⅱ与MHC-Ⅰ横截面积比与环杓后肌相比有显著性差异(P<0.05)(表2,图2)。

表2 各肌肉中MHC-Ⅱ/MHC-Ⅰ个数比及横截面积比

2.4各肌肉nAChR、MHC-Ⅰ、MHC-ⅡmRNA的表达 各肌肉nAChR、MHC-Ⅰ、MHC-ⅡmRNA的表达见表3，可见，环杓侧肌nAChR的mRNA表达量与下颌舌骨肌及甲状舌骨肌比较差异均无统计学意义(P>0.05)，环杓后肌nAChR的mRNA表达量与颏舌骨肌及胸骨甲状肌比较差异均无统计学意义(P>0.05)。环杓侧肌MHC-Ⅰ的mRNA表达高于下颌舌骨肌，与甲状舌骨肌差异无统计学意义(P>0.05);环杓后肌MHC-Ⅰ的mRNA表达低于颏舌骨肌(P<0.05)，与胸骨甲状肌差异无统计学意义(P>0.05)。环杓侧肌MHC-Ⅱ的mRNA表达低于甲状舌骨肌(P>0.05)，与下颌舌骨肌无统计学意义(P>0.05)，环杓后肌MHC-Ⅱ的mRNA表达低于胸骨甲状肌(P>0.05)，与颏舌骨肌差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

图1 各肌肉Karnovsky-Roots亚铁氰化铜法染色图(×400) 1a. 下颌舌骨肌; 1b.甲状舌骨肌; 1c.环杓侧肌; 1d.颏舌骨肌; 1e.胸骨甲状肌; 1f.环杓后肌(黑色箭头所指即为运动终板)

图2 各肌肉的ATP酶法染色图(×200) 2a.下颌舌骨肌; 2b.甲状舌骨肌; 2c.环杓侧肌; 2d.颏舌骨肌; 2e. 胸骨甲状肌; 2f.环杓后肌(蓝色箭头所指即为MHC-Ⅰ肌纤维,黄色箭头所指即为MHC-Ⅱ肌纤维)

表3 各肌肉nAChR，MHC-Ⅰ，MHC-ⅡmRNA表达

3 讨论

单侧声带麻痹(unilateral vocal cord paralysis,UVCP)常表现为声嘶，伴有发声费力、咳嗽、误吸、饮水呛咳、吞咽困难等[7]，双侧声带麻痹(bilateral vocal cord paralysis,BVCP)甚至出现呼吸困难、窒息等症状[8]。当前UVCP的外科治疗手段包括神经或神经肌蒂移植术、甲状软骨成形术、杓状软骨内移术、声带注射成形术 等[9]，BVCP的治疗方法包括气管切开术、神经再支配手术、杓状软骨切除术、声带横断切开术、声带侧移固定术、喉起搏术以及肉毒杆菌注射术等[10]，但存在效果反复、操作复杂、成本高等问题。理论上，重建喉肌的神经再支配并恢复声带的运动功能是治疗喉返神经损伤致声带麻痹最理想的方法；声带运动过程中环杓后肌司声带外展功能，主要由环杓侧肌司声带内收功能。肌肉运动终板产生的电流取决于Ach与nAChR的比例和浓度，同时也受二者结合的速率常数影响，Ach与nAChR结合导致肌肉的动作电位和持续的肌肉收缩[11，12]。本研究结果显示甲状舌骨肌与环杓侧肌的Ach、nAChR和Na+-K+-ATP酶水平无显著性差异，颏舌骨肌与环杓后肌的Ach、nAChR和Na+-K+-ATP酶水平亦无显著性差异；浓度无差异的Ach与乙酰胆碱受体结合，激活Na+-K+-ATP酶通道，从而可以产生相似程度的动作电位和收缩力，本结果与前期肌电研究[3,4]的结论一致。从肌纤维类型看，Ⅰ型肌纤维有抗疲劳的作用，主要在维持固定姿势和长期有氧活动方面发挥作用；Ⅱ型肌纤维在短时间、高强度、快速活动中发挥作用。从本研究结果看甲状舌骨肌与环杓侧肌肌纤维类型相似，MHC-Ⅱ/MHC-Ⅰ个数比、MHC-Ⅰ的mRNA表达方面差异无统计学意义，甲状舌骨肌MHC-Ⅱ/MHC-Ⅰ横截面积比低于环杓侧肌，MHC-Ⅱ的mRNA表达量高于环杓侧肌，颏舌骨肌MHC-Ⅱ的mRNA表达量与环杓后肌无统计学差异，而MHC-Ⅱ/MHC-Ⅰ个数比、 MHC-Ⅱ/MHC-Ⅰ横截面积比, MHC-Ⅰ的mRNA表达量不同，这些不同可能与该肌肉在犬进食过程中的咀嚼运动量、发声以及其他日常生活中负荷程度和生物功能有关，且与肌肉的大小、解剖位置都有一定的相关性。但有研究显示Ⅰ型与Ⅱ型肌纤维可以互相转换，通过增减运动量和运动负荷量可以改变，神经支配改变后也可产生相应变化[13，14]，吸烟等因素也会影响纤维类型的转变[15]。因此，肌纤维类型虽然部分不一致，但是可随身体需求适应而改变。

综上所述，环杓侧肌的Ach、nAChR、 Na+-K+-ATP酶、MEP数量、MHC-Ⅱ/MHC-Ⅰ个数比、MHC-Ⅰ的mRNA表达与甲状舌骨肌比较无统计学差异，甲状舌骨肌与环杓侧肌在乙酰胆碱及组织结构方面有可替代性；颏舌骨肌Ach、nAChR、Na+-K+-ATP酶、MEP数量、MHC-Ⅱ的mRNA表达与环杓后肌类同，虽MHC-Ⅱ/MHC-Ⅰ个数比及横截面积比、MHC-Ⅰ的mRNA表达与环杓后肌差异有统计学意义，但MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ可相互转化，所以该结果表明颏舌骨肌与环杓后肌有可替代性。据此，有利于精准选择相应喉外肌支配神经进行神经或神经肌蒂移植，修复麻痹喉内肌的功能,治疗声带内收或外展麻痹；而且喉外肌与喉内肌邻近，取材方便，创伤较小，不存在排斥反应等。但最终选择神经移植、神经肌蒂移植或多神经肌蒂多点植入，哪种手术方式效果更好，尚需进一步研究。