慢性应激对大鼠认知及小胶质细胞Aβ沉积的影响*

吕霞刘欢12

应激是由社会环境因素引起的非特异性和适应性反应。适当的应激有利于维持机体的稳态，增强机体对不利环境的适应力。然而，长时间应激会使机体生理系统和器官发生改变，导致应激损伤，对机体健康产生有害影响[1]。大脑是应激反应的敏感靶器官，长期应激刺激会改变大脑的结构，扰乱下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)，导致神经元的丢失，海马体的萎缩，进而使认知能力下降[2～4]。流行病学研究发现长期处于应激状态下的人群轻度认知障碍和痴呆症的患病率较同龄非应激状态人群高2倍以上[5]。脑组织内β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积是导致认知功能下降的重要原因之一，慢性应激可升高糖皮质激素水平，促进Aβ沉积[6]，也可通过下调胱硫氨酸β合酶的水平从而升高同型半胱氨酸的浓度，使大脑对β-淀粉样蛋白前体蛋白(APP)处理发生错误，增加Aβ沉积，降低认知功能[7，8]。

小胶质细胞是中枢神经系统的主要免疫细胞，占神经细胞总数的5%～10%，静息状态下的小胶质细胞可在Aβ沉积物周围形成一个保护性屏障，抑制Aβ的扩散，也可吸收和清除可溶性Aβ，防止Aβ的聚集[9]。然而，活化的小胶质细胞可通过信号分子，促进Aβ的产生，也可抑制补体激活途径，降低其吞噬降解Aβ的能力[10]。活化的小胶质细胞表达高水平的晚期糖基化受体(Receptor of Advanced Glycation Endproducts，RAGE)、清道夫受体(Scavenger Receptor，SR)和Toll样受体(Toll-Like Recepetor，TLR)、髓样细胞触发受体2(TREM2)，促进Aβ进入小胶质细胞[11，12]，积累的Aβ可通过一系列反应损伤神经元，导致认知能力减退[13]。近来对痴呆患者和动物模型的研究发现[14，15]，Aβ沉积部位存在着活化的小胶质细胞，这些发现进一步说明了活化的小胶质细胞可能对Aβ沉积和认知能力的减退有影响。 本研究拟探讨慢性应激是否可影响小胶质细胞功能和Aβ沉积，为探索慢性应激影响认知功能的机制提供线索。

1 对象与方法

1.1 对象 实验动物：SPF级雄性SD大鼠16只，体质量(180±20) g，购买于北京斯贝福生物科技有限公司，随机分为模型组和对照组，每组8只。动物饲养在温度为(25±1) ℃，湿度为70%±2%，12 h昼夜循环的环境中。适应性喂养1周后，进行慢性不可预知性刺激(CUMS)造模。

1.2 方法

1.2.1 CUMS模型建立 参考文献采用CUMS方法制备动物模型[6]， 每天从9种应激方式(夹尾2 min、垫料潮湿8 h、昼夜颠倒24 h、摇晃鼠笼15 min、束缚2 h、禁食24 h、禁水24 h、60 Hz噪声1 h、4 ℃冰水游泳5～10 min)中随机选择2种，给予大鼠；为避免大鼠对应激方式产生适应性，3 d内不重复采用相同的刺激方式，持续12周。

1.2.2 旷场实验(Open-filed test) 使用旷场实验来评估大鼠的运动能力和认知功能。实验开始时将大鼠放置于62.5× 74.0× 51.0 cm的黑盒中，自由运动，记录5 min内大鼠的运动距离和静止时间。实验结束后，用75%的酒精擦拭仪器。

1.2.3 高架十字迷宫实验(Elevated-plus maze) 高架十字迷宫由两个开臂(50×10 cm, L×W)和两个闭臂(50×10×40 cm, L×W×H)组成，形状如同一个十字。实验开始时，将每只大鼠放于中央，自由运动5 min，记录其运动的距离和静止的时间。实验结束后用75%的酒精擦拭仪器。

1.2.4 取材 行为学检测结束后，采用水合氯醛(0.3 ml /100 g)麻醉，断头取出完整的大脑组织，浸没于4%中性多聚甲醛固定并过夜，梯度脱水，石蜡包埋，沿大脑组织冠状面进行切片，切片厚度约为3～4 μm，包括皮质和海马区等。

1.2.5 酶联免疫吸附法(ELISA) 测定脑组织内的Aβ1-40和Aβ1-42使用大鼠Aβ1-40和Aβ1-42的ELISA试剂盒，根据说明书的方法和操作步骤进行操作，将脑组织与PBS缓冲液按1∶9的比例稀释，裂解组织后，4 ℃离心15 min后取上清液，测量脑组织匀浆中Aβ1-40和Aβ1-42的浓度。使用BCA蛋白定量试剂盒测定脑组织匀浆上清液的总蛋白量。最后根据蛋白定量的浓度，换算脑组织内Aβ的含量。

1.2.6 免疫荧光(immunofluorescence) 脑组织石蜡切片脱蜡后，与原代多克隆鼠抗Iba-1(1∶100)，兔抗Aβ1-40(1∶100)，兔抗Aβ1-42(1∶100)，兔抗TLR4(1∶100)，兔抗RAGE(1∶100)4 ℃孵育12～16 h，然后与荧光偶联二抗(山羊抗兔，1∶1 000或山羊抗鼠1∶10 000)常温孵育1 h后，最后加入4’，6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)封片，倒置荧光显微镜下观察。

1.2.7 统计学方法 实验数据使用SPSS 25.0和GraphPad Prism 5.0进行分析。所有数据均采用独立样本t检验进行分析，数据均表示为均数±标准差，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CUMS对大鼠认知能力的影响 与对照组比较，模型组旷场实验和高架十字迷宫实验中的静止时间增加(P<0.01)，运动距离缩短(P<0.05)。见表1。

表1 两组认知能力比较

2.2 CUMS对大鼠脑内Aβ的影响 与对照组比较，模型组大鼠脑内Aβ1-40和Aβ1-42水平均升高(P<0.05)。见表2。

表2 两组大鼠脑内Aβ水平比较

2.3 CUMS对小胶质细胞的激活和小胶质细胞内Aβ含量的影响 与对照组比较，模型组大鼠海马区和皮质区活化的小胶质细胞的数量增加(P<0.05)；模型组大鼠海马区和皮质区中小胶质细胞内的Aβ1-40和Aβ1-42增加(P<0.05)。见表3，表4，图1。

表3 CUMS对小胶质细胞激活的影响

表4 两组小胶质细胞内Aβ含量比较

2.4 CUMS对小胶质细胞Aβ吞噬受体RAGE和TLR4表达的影响 与对照组比较，模型组海马和皮质区内的小胶质细胞内TLR4和RAGE表达增加(P<0.05)。见表5，图2。

表5 两组小胶质细胞Aβ吞噬受体RAGE和TLR4表达比较

注：海马冠状切片图标尺=50 μm(200×)

注：海马冠状切片图标尺=50 μm(200×)

3 讨论

慢性应激是认知能力下降和痴呆发生的强危险因素，会增加痴呆的发病率，提前痴呆的发病年龄[16]。本研究使用旷场实验和高架十字迷宫两种方式验证慢性应激对动物认知功能的影响，结果均显示其探索能力和认知运动能力降低，提示慢性应激可诱导大鼠出现认知能力的下降。

本研究发现，模型组大鼠脑内Aβ含量增加，海马区与皮质均有沉积。Aβ主要以Aβ1-40和Aβ1-42的形式存在于脑内，其中 Aβ1-40作为主要的可溶性Aβ形式，其数量较Aβ1-42多，但Aβ1-42更易纤维化聚集成斑块，具有较强的神经毒性[17，18]。本研究发现脑内Aβ1-42的浓度比Aβ1-40低，与以上研究一致。生理情况下Aβ的生成和降解处于动态平衡，使Aβ1-40和Aβ1-42维持在较低水平[19]。有研究发现6周CUMS刺激导致大鼠脑内Aβ的轻微增加[8]。更有研究显示慢性应激刺激可导致APP裂解酶的活性异常增高，小胶质细胞吞噬清除Aβ的能力受损，脑内Aβ异常沉积，可导致认知功能障碍发生[20]。海马和皮质是调控记忆力和认知功能的主要脑区，当海马和皮质区内Aβ含量升高时，尤其Aβ1-42的浓度增加时，可促进老年斑块的形成，减退认知功能[21]。本研究使用12周CUMS刺激，造成慢性应激，发现大鼠脑组织皮质及海马区内Aβ1-40和Aβ1-42含量均增加，认知运动功能下降。以上现象可能与，在CUMS造模下，大鼠脑组织内Aβ不断累积，进一步诱导下游的级联反应，减退认知能力有关[21]。

小胶质细胞是中枢神经系统的主要免疫细胞，介导炎症反应，参与神经元的正常连接，调节正常的认知功能[22]。本研究发现，CUMS大鼠脑组织皮质和海马区小胶质细胞激活。有研究显示，慢性刺激下，小胶质细胞激活，介导产生促炎性细胞因子，使小胶质细胞吞噬清除Aβ的能力受损[20]。本研究表明，CUMS造模下，脑组织小胶质细胞内Aβ水平升高。细胞内Aβ水平升高可能与细胞外Aβ生成增多、细胞内降解下降有关。激活的小胶质细胞分泌各种信号分子作用于其他神经细胞导致Aβ生成增多[23]，还可减少脑内胰岛素降解酶的分泌，抑制Aβ的降解，导致Aβ沉积[12]。活化的小胶质细胞清除Aβ的能力降低，促进Aβ的积累，导致认知障碍病理进程的发展[24]。

RAGE和TLR4在中枢神经系统的小胶质细胞内高表达，研究发现，Aβ与小胶质细胞表面的RAGE或TLR4结合，诱导小胶质细胞的激活，使炎症水平升高，可能引起神经元损伤，导致学习、记忆和认知能力降低[25]。在AD患者和动物中均发现，脑(包括海马区)内小胶质细胞中RAGE和TLR4表达增加，且当小胶质细胞向Aβ靠拢时，其将高度表达细胞表面受体RAGE和TLR4等，从而使受体能够识别Aβ并与之结合摄入细胞内，使脑内Aβ的水平增加[26]。本研究发现，大鼠脑组织中小胶质细胞在12周慢性刺激下被激活，并可能上调小胶质细胞内RAGE和TLR4受体表达，促进对Aβ的吞噬，进而导致细胞内Aβ的积累。

综上，慢性应激可引起脑内Aβ含量增加和认知能力的减退，这可能与激活脑内小胶质细胞，小胶质细胞Aβ摄取受体RAGE和TLR4表达上调，造成小胶质细胞对Aβ的摄取增加、清除减弱有关。