基于几何形态学对三种豹头骨的初步分析

周用武，李怡婷

（1.南京森林警察学院 刑事科学技术学院，南京210023；2.国家林业局森林公安司法鉴定中心，南京210023；3.野生动植物物证技术国家林业局重点实验室，南京210023）

依照我国《野生动物保护法》以及CITES的规定，除科学研究、驯养繁殖等特殊情况外，国家禁止猎捕、杀害、收购、运输、出售和进出口亚洲大型猫科动物及其制品．但是，破坏亚洲大型猫科动物资源的违法犯罪活动在我国还是十分猖獗[1]．我国目前对豹亚科动物头骨的研究不多，对豹亚科动物的研究主要集中在豹皮毛的种属认定[2]、相关制品的价值及种属认定[3]、生存环境保护[4]等方面．

近些年来，几何形态学被广泛应用于古生物学的鉴定[5-6]，而且逐步扩展到对现生动物外形的研究．如：苏筱雨等[7]利用小盾片的几何形态特征对10种鳃金龟Melolonthidae进行了准确识别．马智[8]利用几何形态测量方法对比翅脉形态上的差异成功鉴别了舞毒蛾Lymantria dispar、模毒蛾L.monacha和木毒蛾L.xylina三种毒蛾．王虹[9]基于几何形态学对不同生态型黄鼬Mustela sibirica的头骨功能进行了研究．几何形态测量也被广泛应用于涉及头骨的相关问题中[10-13]，但实验的检材大多是兔形目、啮齿目动物头骨或者人类颅骨，猫科动物的头骨未曾涉及．

目前我国司法实践中，对于豹头骨种属认定的方法大多采用DNA鉴定技术，然而此技术不仅会破坏检材，而且设备价格高昂，不适合普遍应用[14]．另外，豹亚科动物的头骨不同种之间形态差异微小，相关工作人员若通过观察外部形态的方法来判断鉴别其来源物种，则需要长期的经验积累，同时对鉴定人员的专业水平和业务功底要求较高，鉴定的结果有较强的主观性且作为定案根据比较勉强．基于几何形态学探究头骨形态上的差异，并采用计算机程序判断，减少人为判断的主观性和差错，会更简便快捷，客观性更强．本文选取豹亚科的云豹Neofelis nebulosa、雪豹Pantera uncia和豹Panthera pardus的头骨作为研究样本，基于几何形态学探讨它们形态上的差异，结合程序判别相应的物种，尝试寻找或建立一套既方便又快捷，可操作性强且准确性高的豹类头骨的鉴定方法或体系，以便于公安机关认定濒危物种的种属，进而打击查处相关环境资源类犯罪，同时也能提高工作效率．此外，本工作也为后期开发猫科动物头骨的图像自动识别系统积累基础资料．

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料取自国家林业局森林公安司法鉴定中心收到的涉案检材，包括哺乳纲MAMMALIA猫科Felidae豹亚科Pantherinae的云豹Neofelis nebulosa、雪豹Pantera uncia、豹（俗名金钱豹）Panthera pardus，分类参照《中国兽类名录》（2021版）[15]．首先对涉案检材进行拍照记录，然后采用DNA技术鉴定检材，根据鉴定结果选取拍照记录的检材进行标记．共选取其中3种豹的头骨各2枚，用于几何形态测量的图片为对应的3种豹头骨背面照片各2张．

1.2 头骨传统形态信息获取

利用游标卡尺对3种豹头骨的颅全长——图1（a）中P与A两点间距离，颅基长——图1（b）中P与B两点间距离，颧宽——图1（a）中Zy与Zy两点间距离、上颌齿列长——图1（b）中Pm与Pd两点间的距离，眶间宽——图 1（a）中Ect与Ect两点间距离进行多次测量，记录数值，数据精确到0.01 mm．

图1 基本度量示意图[16]

1.3 头骨几何形态信息获取

1.3.1 图像获取与处理

固定相机和比例尺的位置，使用水平仪调整角度将相机与拍摄面垂直，拍摄的图片格式保存为RAW格式．将RAW格式的图片文件导入到Photoshop2021，使用camera raw工具对图片进行灰度处理，提高对比度，增加暗部曝光以及整体曝光度，分图层减少背景曝光，便于对图像进行形态特征的提取及研究．

1.3.2 标定地标点

目前在几何形态学的测量中较为常用的一种标点方法即为标定地标点法．这种方法的基础是利用笛卡尔坐标，将不同样本中标定的地标点在形态上的差异矢量化，转化为相应的数学函数[17]．通过tpsUtil32软件将图片转化为TPS文件，使用tpsDig232软件打开TPS文件后进行标点．根据图片中的比例尺，逐一设置比例（set scale）．标点方式为从头骨的前颌骨最前端中点到头骨最后缘的突出点，顺时针依次标记13个地标点，每张图片的标点顺序相同、数量相等且位置尽可能一致，详见图2．

图2 豹头骨的13个地标点

1.3.3 形态数字信息化

利用tpsDig232将标定的3组地标点进行数字化处理，并利用Past4.01软件将3组数据整合到一起．

1.4 传统形态学数据分析方法

使用Microsoft Excel软件计算3种不同的豹头骨在传统形态学测量方法下的平均值、标准差、最大值、最小值和变异系数（CV%）等基本统计量．在Past4.01软件中对数据逐组进行A-D检验（P＞0.05），验证数据符合正态分布；接着通过Levene方差齐性检验（P＞0.05），在满足以上标准的前提下进行单因素方差分析．对体现形态特征的数据进行单因素方差分析，判断这些特征是否在不同种类之间存在显著差异（P＜0.05）．

1.5 几何形态学数据分析方法

利用Past4.01软件完成对数据的普氏叠加分析，目的是通过平移、旋转或缩放等各种方式消除非形状上的因素差异．最后利用SPSS软件对经过普氏叠加后得到的标准数据进行判别分析和多变量方差分析，以此来对豹头骨的种间形态差异进行比较．

2 结果与分析

2.1 传统形态学差异分析

3种豹头骨的传统形态测量结果（表1）和差异分析如下：

表1 3种豹头骨传统形态测量学的基本统计量

3种头骨种间颅全长差异显著（F=10.01，df=3.957，p=0.028 29），雪豹和云豹颅全长差异显著（P=0.026 78），云豹和豹颅全长差异显著（P=0.005 869），雪豹和豹颅全长差异不显著（P=0.392 7＞0.05）．

3种头骨种间颅基长差异不显著（F=6.687，df=3.986，p=0.053 27＞0.05），云豹和豹颅基长差异显著（P=0.015 5），雪豹和云豹颅基长差异不显著（P=0.120 2＞0.05），雪豹和豹颅基长差异不显著（P=0.281＞0.05）．

3种头骨种间颧宽差异不显著（F=3.177，df=3.909，p=0.151 6＞0.05），云豹和豹、雪豹和云豹、雪豹和豹颧宽差异均不显著（P=0.183 4、0.142 5、0.978 6＞0.05）．

3种头骨种间上颌齿列长差异不显著（F=0.337 3，df=3.94，p=0.732 5＞0.05），云豹和豹、雪豹和云豹、雪豹和豹上颌齿列长差异均不显著（P=0.645 7、0.956 5、0.804 6＞0.05）．

3种头骨种间眶间宽差异不显著（F=5.689，df=3.993，p=0.067 79＞0.05），雪豹和云豹眶间宽差异显著（P=0.027 75），云豹和豹、雪豹和豹眶间宽差异不显著（P=0.743 3、0.069 36＞0.05）．

2.2 几何形态学差异分析

2.2.1 判别分析

典则判别需根据样本点计算判别函数，计算判别函数到各类中心的欧式距离，取距离最小的类别．首先是对观测变量进行分类并赋权重，观测变量数据表中的类别=1为豹，类别=2为雪豹，类别=3为云豹；3种豹的每个观测变量权重均为1，总权重分别为2、2、2，共有6个观测量，总权重为6．然后进行组平均值的同等检验，威尔克Lambda值范围在0～1之间，所有的观测值都小于1，代表组均值在统计意义上均有区别．根据结果可知，大部分数值都小于0.05，表示组均值不同，即其差异有统计意义．其中Y3、Y4、Y9、Y11（分别为豹头骨第3、4、9、11标定点的纵坐标）．组间均值差异相近，没有统计意义．

两个典则判别函数的累计贡献率达到100%，可利用豹头骨的X1、Y1、X2的坐标值对豹、雪豹、云豹进行判别．建立两个典则判别函数，具体如下：

式中X1是豹头骨第一个标定点的横坐标；Y1是豹头骨第一个标定点的纵坐标；X2是豹头骨第二个标定点的横坐标．

利用两个典则判别函数，通过计算得到3种豹头骨标记点普氏叠加后的典则判别散点图（图3）．由图3可以看出，经过普氏叠加消除3种豹头骨标记点的非形状因素影响后，每种豹的头骨都聚集在各类别的组质心处，聚集效果非常紧密，可得出判别的效果非常准确．

图3 3种豹头骨的典则判别散点图

贝叶斯判别首先假定各分类的先验概率相等，即各分类的先验概率为1/3，然后建立3个分类函数，具体如下：

式中X1是豹头骨第一个标定点的横坐标；Y1是豹头骨第一个标定点的纵坐标；X2是豹头骨第二个标定点的横坐标．通过计算得到3种豹头骨的分类判别结果（表2）．

表2 3种豹头骨的分类结果

由表2分析结果可得，利用3种豹头骨标记点普氏叠加后的数据进行判别分析，判别正确率为100%．

2.2.2 多变量方差分析

单因子多变量MAOVA的显著性检验结果中4种统计检验量的P值均小于0.05，已达到显著水平，表示雪豹、云豹、豹在13个因变量的平均数存在显著差异．为了进一步探究3种豹在哪些因变量的平均数存在显著差异，进行多组间区别分析和事后比较，结果显示 3 种豹头骨两两之间的Y5、X6、X7、Y7、X9、X10、Y11、X13均存在显著区别，其他点有部分区别不显著．

3 讨论

3.1 形态定量分析的结果与优势

3种豹的头骨形态高度相似，区分难度较大．在传统的形态鉴定中，没有明确的量化标准，关于豹类头骨传统形态鉴定的文献中相关描述笼统且模糊，鉴别检索表中多用“较窄”“较宽”“稍低”“较低”等词汇进行表述[18]，鉴定时容易受主观因素的影响．

通过几何形态学对豹亚科的雪豹、云豹、豹进行头骨的形态定量分析，结果表明3种豹头骨在形态上存在较大的差异，并能准确找到差异点，实现了3种豹头骨的区分与判别．通过几何形态学测量分析，3种豹的头骨后缘、额骨眶后突、颧弓、颧突是3种豹形态差异显著的部位，因此在形态学的鉴定中，可以着重关注以上部位．几何形态学的分析还提示区分豹和雪豹的头骨时可着重关注鼻骨、颧突和额骨眶后突部位；豹和云豹的头骨区分可着重关注前颌骨、鼻骨、头骨后缘、额骨眶后突和冠状突部位；雪豹和云豹的头骨区分可着重关注鼻骨、头骨后缘、颧突、额骨眶后突、冠状突和颧弓部位．

利用几何形态学实现对猫科动物头骨判别鉴定的方法，打破了传统的特征检索表鉴定或者DNA鉴定的思路，克服了传统形态鉴定主观性强、专业性要求高等缺点，鉴别分类的效果更加直接明了．

3.2 几何形态鉴定豹头骨方法的局限性

本实验在数据提取的过程中，采用的是tpsDig232软件手动标点法对3种豹6张图片的相同部位标点以提取数据，因此存在一定的误差．

客观上，头骨的形态受年龄或雌雄因素影响[17]．随着豹年龄的增长，其头骨各项指标会有不同程度的增长或扩大，对不同年龄的豹或者年龄差异较大的不同种豹头骨进行判别鉴定时，形态差异的准确性有待进一步核实与确定．另外雄豹与雌豹的头骨也在一定程度上存在差异，若无法确定豹的雄雌，则可能对实验结果的准确性产生影响．

不同地域的经纬度、海拔、温度等因素也会影响豹头骨的变异[16]．我国幅员辽阔，不同地区的生境有很强的差异性．例如：西部高山、西南盆地、南部岛屿等不同地区都分布有活动的豹类，受环境因素的影响，其头骨均会产生一定程度的形态变异．因此需要对检材的来源进行确认，若无法确认检材来自同一地域，则可能会对实验的结果造成影响．

3.3 应用前景与研究展望

本文通过几何形态学成功区分了豹亚科的3种豹，几何形态学测量相比于传统的形态测量排除了样本大小的干扰，只通过头骨上几个重要的地标点在几何形态上的差异实现不同种类的区分．这种方法与传统的形态鉴定和DNA鉴定技术相比简单便捷、可操作性强、成本低，因此在实际的鉴定工作中具有非常重要的意义以及良好的发展前景．在今后的鉴定中还可以在以下方面进行深入研究：

建立三维模型．本文是在二维空间中对检材的图片进行标点得到数据后进行的分析，随着三维激光扫描技术的不断发展[19]，可以尝试将该项技术运用于头骨的几何形态学研究中．控制好精度，通过CT扫描获取的三维几何形态信息可以更好地反映不同种头骨间的差异[20]．相较于二维空间的形态数据，三维的数据更加客观精确，呈现的结果也更加立体化．

建立几何空间形态数据库．2013年，汪露等[21]通过研究开发了果实蝇属昆虫图像识别系统，通过该系统可实现多种实蝇的鉴定．因此可借鉴前人的经验，建立猫科动物头骨的几何空间形态数据库，通过计算机技术与人工智能技术获取数据并与数据库比对，判别相应的物种，为猫科动物头骨的图像自动识别系统奠定基础．同时可进一步减轻鉴定人员的工作压力和去专家化，以实现快速高效的鉴定．