响应面法优化东革阿里中蛋白质的提取工艺*

张远芳，郭雨璐，王桂霞，夏娟娟，邱继双，刘 芳

(湘南学院药学院，湖南 郴州 423000)

东革阿里(Eurycomalongifolia)是苦木科东革阿里属植物[1]，又称为天然伟哥、乡土人参、马来西亚人参等，被当地视作国宝级药材之一，主要分布在东南亚国家，比如印度尼西亚、马来西亚、越南等国家，一般生长于海边森林以及海拔在700 m以下的原生从林或者次生从林。其作为传统药材，药用历史悠久，东革阿里整株具极高的药用价值，但常常以其根部入药，东南亚民间主要用于治疗男性性功能障碍[2]、抗疟疾[3]以及抗癌[4]等，现代药理研究表明，东革阿里还具有降血压、降血糖、抗焦虑及抗骨质疏松等多种功效[5-7]。东革阿里主要化学成分有萜类和生物碱类，除此之外还含有挥发油、甾醇、蛋白质、木脂素等成分[8]。

蛋白质是人体重要的基础物质，其中植物蛋白较一般谷物、豆类氨基酸种类多，具有较高的食用价值，有必要进行深入研究[9]。目前蛋白质的提取方法工艺主要有碱提酸沉法[10]、微波法[11]、盐溶法[12]等，其中碱提酸沉法因其成本低，操作简便而应用广泛。目前，关于东革阿里的研究主要集中在生物碱类、萜类等成分及其生物活性的研究[13]，而对于东革阿里中蛋白质的组成、功能性质研究未见报道。因此，本文以东哥阿里为原料，采用碱提酸沉法提取东革阿里中的蛋白质，以单因素实验数据为基础，再结合利用响应面法优化其提取工艺，为东哥阿里的综合利用和深入开发研究提供参考依据。

1 材 料

1.1 药物和主要试剂

东革阿里，购自马来西亚药材市场，由湘南学院刘鹏老师鉴定为苦木科东革阿里属东革阿里，标本保存于湘南学院的湖南省教育厅医药微生物组学重点实验室(标本编号：20130916DGAL)。酪蛋白、考马斯亮蓝，阿拉丁试剂有限公司；乙醇、氢氧化钠、盐酸、磷酸均为分析纯；水为超纯水。

1.2 主要仪器

YB-2000A高速多功能粉碎机，永康市速锋工贸有限公司；752紫外可见分光光度计，上海元析分析仪器有限公司；TDZ4A-WS台式低速离心机，济南好来宝医疗器材有限公司；FA1604电子天平，上海精科天平仪器厂；HH-2数显恒温水浴锅，江苏科析仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 东革阿里粉末的制备

取东革阿里药材切片通过鼓风干燥箱进行烘干，粉碎，过筛(60目)，得到药材粉末，备用。

2.2 考马斯亮蓝染液配制

精确称取50 mg考马斯亮蓝试剂，用95%乙醇溶液25 mL进行溶解，然后加入85%的浓磷酸100 mL，蒸馏水稀释至200 mL得储备液，存于棕色瓶。临用前用超纯水按1:5的比例稀释，配制成考马斯亮蓝染液。

2.3 酪蛋白标准曲线的绘制

标准酪蛋白溶液的配制：准确称取75 mg酪蛋白于50 mL容量瓶中，用 0.01 mol/L氢氧化钠溶液定容，得1.5 mg/mL的标准蛋白溶液。取不同体积的标准蛋白溶液稀释成系列标准蛋白质溶液，依次吸取系列标准蛋白质溶液各1 mL，分别加入考马斯亮蓝染液5 mL，混匀后静置2 min，测定在波长595 nm下的吸光度值A595，以酪蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制酪蛋白的标准曲线。

2.4 东革阿里蛋白质等电点(pI)的测定

参考文献[14]，利用蛋白质在溶剂中溶解度最低时的pH为蛋白质等电点原理。如表1所示，取7支规格相同的干燥试管，分别编号，按下表顺序准确地加入各种试剂，加入每种试剂后混合均匀。静置20 min，观察每支试管溶液的浑浊度，以+、++、+++、++++、+++++表示溶液的浑浊程度。结果发现4号试管最浑浊，因此测定pH=4.7为东革阿里蛋白质等电点。

表1 测定蛋白质等电点情况表Table 1 Isoelectric point of Eurycoma longifolia protein

2.5 东革阿里蛋白质提取

参考文献[15]，利用碱提酸沉法提取东革阿里蛋白质，称取适量的东革阿里粉末按照一定料液比(1:10～1:40) g/mL加入超纯水，用0.1 mol/L NaOH溶液调节溶液pH至(9～12)，在一定温度(30～60 ℃)下，提取一段时间(1～2.5 h)，冷却过滤取滤液，用0.1 mol/L HCl调节pH至东革阿里蛋白质等电点，静置12 h后，在4000 r/min的条件下离心15 min，取沉淀水洗用0.1 mol/L NaOH溶液调节至中性，得东革阿里蛋白质溶液。

2.6 东革阿里蛋白质提取率的测定

采用Bradford方法对东革阿里蛋白质溶液中的蛋白质进行含量测定。量取“2.4”项下东革阿里蛋白质溶液1 mL于试管中，加入5 mL考马斯亮蓝染液，振荡混匀，静置2 min，测量在595 nm下的吸光度值 A595，代入酪蛋白的标准曲线计算提取液中的蛋白质的浓度，根据以下公式计算提取率：

东革阿里蛋白质提取率(%)=提取液中蛋白质质量/样品的质量×100%

2.7 单因素试验

以东革阿里蛋白质提取率为指标，分别考察提取时间(0.5、1、1.5、2、2.5 h)、料液比(1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL)、温度(30、40、50、60、70 ℃)， pH值(9、10、11、12)进行单因素实验，研究各因素对东革阿里蛋白质提取率影响，确定最优提取工艺参数以进行后续的响应面试验。

2.8 单因素实验响应面优化设计试验

在“2.6”项单因素试验所得的数据基础上，根据Box-Behnken试验理论，选取提取时间(A)、料液比(B)、温度(C)、pH值(D)这四个单因素为自变量，运用软件Design Expert 8.0.6进行响应面试验优化设计，编码见表2所示。

表2 响应面试验设计因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface design

3 结果与分析

3.1 酪蛋白标准曲线

图1 酪蛋白标准曲线Fig.1 Standard curve ofcasein

按照“2.3”项下的方法，得到酪蛋白的标准曲线如图1所示，回归方程为：A=0.1603C+0.3058(R2=0.9950)，线性范围为0.15～1.35 mg/mL，可用于东革阿里蛋白质含量的测定。

3.2 单因素试验结果

3.2.1 提取时间对东革阿里蛋白质提取率的影响

图2 提取时间对东革阿里蛋白质提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of protein from Eurycoma longifolia protein from citrus peel

由图2可见，0.5～1.5 h之间，东革阿里蛋白质提取率呈现逐步上升，1.5～2.5 h之间，提取率逐渐下降，当提取时间到达1.5 h时，东革阿里蛋白质提取率达最大值1.26%，再继续增加提取时间，可能由于长时间的加热，对蛋白质的结构和活性产生影响，导致提取的蛋白量减少，降低了提取率。综上，选取1.5 h为0水平，进行响应面试验。

3.2.2 料液比对东革阿里蛋白质提取率的影响

图3 料液比对东革阿里蛋白质提取率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of protein from Eurycoma longifolia protein from citrus peel

由图3所示，随着料液比的不断增加，东革阿里蛋白质提取率存在先升高后下降的趋势，其中在1:10～1:30(g/mL)之间时，东革阿里蛋白质提取率随着料液比的增加而显著升高，在1:30～1:50(g/mL)之间，东革阿里蛋白质提取率反而下降，可能原因是料液比越大，增大了提取液黏度，影响蛋白质的溶出，导致不能充分提取东革阿里中的蛋白质，降低其蛋白质提取率，因此选择料液比1:30(g/mL)为0水平，进行后续的响应面试验。

3.2.3 温度对东革阿里蛋白质提取率的影响

图4 温度对东革阿里蛋白质提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of protein from Eurycoma longifolia

由图4可知，东革阿里蛋白质提取率随提取温度的升高，先增大后减小，当温度在50 ℃时，东革阿里蛋白质提取率最大。最初升高温度有利于蛋白质的扩散、溶出，故提取率增大，而当温度高于50 ℃时，可能出现蛋白质受热变性，黏度增加，或杂质溶解度增大等，导致东革阿里蛋白质提取率减小。因此选择温度为50 ℃进行后续的响应面试验。

3.2.4 pH对东革阿里蛋白质提取率的影响

图5 pH对东革阿里蛋白质提取率的影响结果Fig.5 Effect of pH on extraction rate of protein from Eurycoma longifolia

由图5所示，东革阿里蛋白质提取率随着pH的变化先上升后下降，于pH=11 时，东革阿里蛋白质提取率达到最大值1.89%，当溶液pH>11时，东革阿里蛋白质提取率下降，这可能是因为蛋白质于强碱条件下溶解度较大，而当pH>11会破坏蛋白质结构，同时淀粉会糊化，不易于蛋白质的溶出，导致蛋白质提取率下降。故选取pH为11进行后续的响应面试验。

3.3 响应面优化东革阿里蛋白质提取工艺试验

3.3.1 响应面优化条件设计及结果

以4个单因素为自变量，以东革阿里蛋白质提取率的值为响应面的响应值，通过利用Box-Behnken方法进行设计优化试验，具体设计方案及结果见表3所示。

表3 东革阿里蛋白质工艺响应面试验设计结果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis of Eurycoma longifolia protein

3.3.2 响应面模型的建立和分析

通过Design-Expert 8.0.6软件对响应面结果进行拟合分析，得到以提取时间、料液比、温度、pH 为自变量，以东革阿里蛋白质提取率为响应面响应值的二元回归方程：

蛋白质提取率Y=2.06+0.39A+0.093B+0.036C+0.4D+0.012AB-0.13AC+0.083AD-0.045BC-7.5×10-3BD-0.095CD-0.36A2-0.51B2-0.82C2-0.65D2

表4 回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance in regression model

根据表3数据进行相应的方差分析，结果见表4。此模型的回归系数R2=0.9509，决定系数RAdj2=0.9018，说明提取率的实际值与预测值在试验范围内拟合较好，该模型P<0.0001具有极显著性，失拟误差P=0.4266>0.05，表示失拟项不显著，说明该模型拟合度良好，实验方法设计合理，对响应面的变化具有较好的反映。通过比较各因素的F值，可依次得出对试验指标影响程度的大小，依次排序为pH(D)>提取时间(A)>料液比(B)>温度(C)。根据P值大小，可知模型中一次项A、D极显著，二次项A、B、C、D极显著，交互项均不显著，表明各因素之间交互效应较弱，各因素与东革阿里蛋白质提取率之间不是简单的线性关系。

3.3.3 响应面分析

通过响应面3D图的曲面坡度程度，直观反映每两个因素之间对东革阿里蛋白质提取率的影响程度。响应面曲面越陡，表明两个因素的交互作用影响越大，对响应值的影响越大，反之影响越小。如图6a～图6f所示，其中pH和提取时间的曲面最陡，交互作用较明显，对东革阿里蛋白质提取率的影响较为显著。

图6 各因素交互作用对东革阿里蛋白提取率影响Fig.6 The effect of interaction of various factors on the extraction rate of Eurycoma longifolia protein

3.3.4 最佳工艺条件的验证试验

利用Design-Expert 8.0.6软件对东革阿里蛋白质提取工艺参数进行优化，确定最佳工艺条件为：提取时间为1.8 h、料液比为1:30.99(g/mL)、温度为49.51 ℃、pH为11，预计东革阿里蛋白质提取率为2.25%。考虑实际的试验操作性，将工艺参数修正为：提取时间为1.8 h、料液比为1:30(g/mL)、温度为50 ℃、pH为11。平行进行3次试验，得到蛋白质的提取率为2.04%。该结果与模型预测值基本一致。可见，此模型适用东革阿里蛋白质提取，方法具有可行性。

4 结 论

本实验采用碱提酸沉法提取东革阿里中的蛋白质，在单因素基础上结合响应面法优化其提取工艺，建立的模型能较好的预测东革阿里蛋白质含量，并确定最佳提取工艺为：提取时间为1.8 h、料液比为1:30(g/mL)、温度为50 ℃、pH为11，东革阿里中蛋白质的提取率为2.04%。此工艺设计合理，方法简单，重复性好，为东革阿里蛋白质的开发利用提供科学依据。