小果型西瓜耐低温弱光种质资源遗传多样性的SSR分析

李晓慧，赵卫星，康利允，梁慎，常高正，李海伦，王慧颖，徐小利，高宁宁

(河南省农业科学院园艺研究所，河南 郑州 450002)

西瓜(Citrullus lanatus)属于葫芦科，是一种重要的经济作物。小果型西瓜由于熟性早、品质佳，越来越受消费者青睐，种植面积也逐年扩大[1]。小果型西瓜在生长发育过程中受温度和光照的影响较大，早春的低温弱光会抑制西瓜生长，使其发育不良，造成西瓜减产、品质下降[2]。目前，最经济有效的方法是选育耐低温弱光品种，但小果型西瓜的种质资源匮乏，遗传基础较为狭窄，对小果型西瓜种质资源遗传多样性和亲缘关系进行分析，有利于种质资源的更好利用和创新。

SSR分子标记是以PCR为基础发展起来的分子标记技术，一般是由重复的几个核苷酸为单位组成的串联序列。利用SSR分子标记技术对西瓜的研究主要在指纹图谱构建[3－5]、品种纯度鉴定[6－8]以及遗传多样性[9－12]等方面。前人对西瓜耐低温弱光种质的研究多集中在生理生化[13－15]和分子机理方面[16－18]，未见有关于西瓜耐低温弱光种质资源的遗传多样性研究。因此，本研究利用SSR分子标记对耐低温弱光和不耐低温弱光共32份西瓜种质资源进行亲缘关系分析，以期为耐低温弱光西瓜种质资源的合理利用和遗传育种提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试32份小果型西瓜材料为河南省农业科学院园艺研究所经过多年收集及创新的品种(系)。其中，1~10号为耐低温弱光型，11~32号为不耐低温弱光型(表1)。

表1 供试32份小果型西瓜品种

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 试验于2021年4月在河南省农业科学院园艺研究所温室取样，在西瓜长至两叶一心时，取100 mg幼嫩真叶，在破碎仪中进行破碎，利用改良的CTAB法[19]提取DNA，将提取的原液稀释至30 ng/μL，－20℃保存备用。

1.2.2 SSR扩增及检测 SSR反应采用15μL体系:2×MasterMix 7.5μL(购自BioTeke公司)，DNA模板(30 ng/μL)1μL，正、反向引物(0.4 μmol/L)各0.4μL，ddH2O 5.7μL，反应程序参考黄春琼等[20]。选取耐低温弱光和不耐低温弱光的西瓜品种各1份对50对SSR引物组合进行筛选(表2)，采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，具体参考梁宝萍等[21]的方法，筛选扩增位点稳定清晰且多态性高的引物用于分析供试小果型西瓜材料。

表2 引物序列

1.3 数据分析

利用Microsoft Excel软件统计原始数据矩阵，人工读带将图谱上出现条带的记为“1”，无条带的记为“0”。使用NTSYS－pc 2.1e软件中的UPGMA方法获取遗传相似系数，利用Treeplot模块对数据进行聚类分析；用PopGen Version 3.2软件计算不同类型小果型西瓜的遗传多样性指数，包括观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样性指数(H)、Shannon’s信息指数(I)、遗传一致度和遗传距离等，并用Cophenetic相关性方法对相似系数矩阵和聚类分析结果的相关性进行检验。

2 结果与分析

2.1 SSR扩增多态性

从50对SSR引物中筛选出21对稳定、清晰且多态性高的引物，对32份小果型西瓜进行扩增，共得到201个多态性位点，平均每对引物可扩增出多态性位点9.6个，多态性比率为74%(表3)，扩增片段的长度在80~500 bp之间。其中，Pr25多态性位点最多，为26个(图1)，Pr8和Pr18扩增多态性比率可达90%以上，Pr30多态性比率最低，为38%。

图1 引物对Pr25对32份西瓜的SSR扩增图

表3 SSR扩增多态性

2.2 不同类型西瓜种质间的遗传多样性

遗传多样性指数计算结果(表4)显示，耐低温弱光和不耐低温弱光两种类型供试小果型西瓜的观测等位基因数(Na)分别为1.6333、1.7111，总体值为1.7556；有效等位基因数(Ne)分别为1.3395、1.3658，总体值为1.3929；Nei’s基因多样性指数(H)分别为0.2046、0.2186，总体值为0.2366；Shannon’s信息指数(I)分别为0.3117、0.3337，总体值为0.3614。由以上数据可知，供试32份小果型西瓜种质具有较丰富的遗传多样性，不耐低温弱光小果型西瓜遗传多样性指数均高于耐低温弱光型，表明不耐低温弱光型西瓜遗传多样性比耐低温弱光型丰富。耐低温弱光和不耐低温弱光两种类型供试小果型西瓜的遗传一致度为0.9340，遗传距离为0.0682(表5)，表明两种供试小果型西瓜亲缘关系较近。

表4 不同类型西瓜品种(系)遗传多样性指数

表5 不同类型西瓜品种(系)遗传一致度和遗传距离

2.3 不同类型西瓜种质间的聚类分析

供试西瓜的遗传相似系数在0.60~0.92之间(表6)。耐低温弱光小果型西瓜‘S5’和不耐低温弱光小果型西瓜‘金冠’、耐低温弱光小果型西瓜‘MW020’和不耐低温弱光小果型西瓜‘A20－6’两组的遗传相似系数最小，为0.60，说明两组之间的亲缘关系最远。不耐低温弱光小果型西瓜‘S7’和‘S8’的遗传相似系数最大，为0.92，说明两者之间的亲缘关系最近。

表6 32份西瓜种质遗传相似系数

利用NTSYS－pc 2.1e软件对21对SSR引物获得的多态性数据进行分析，以遗传系数0.73为界，通过UPGMA聚类，可将32份供试小果型西瓜材料分为4大类(图2)，耐低温弱光小果型西瓜分布在Ⅰ、Ⅱ大类，不耐低温弱光小果型西瓜在4大类中均有分布。第Ⅰ大类8个品种，包括6份耐低温弱光型和2份不耐低温弱光型；第Ⅱ大类5个品种，包括4份耐低温弱光型和1份不耐低温弱光型；第Ⅲ大类仅包含1个不耐低温弱光品种；第Ⅳ大类18个品种，均为不耐低温弱光品种。

图2 32份西瓜种质聚类分析

Cophentic相关性可以反应遗传相似系数矩阵和UPGMA聚类结果矩阵间的关联程度。通过Cophentic检验得出两个矩阵的相关系数(r值)为0.75，说明遗传相似性原始数据与UPGMA聚类结果之间有密切的关联性，聚类结果准确。

3 讨论与结论

本试验选取50对SSR标记引物对32份小果型西瓜供试材料进行遗传多样性分析，共得到201个多态性位点，平均每对引物扩增出多态性位点9.6个，多态性比率可达74%，选取引物的扩增多态性较高，说明筛选出的21对SSR引物可用于分析西瓜种质的遗传背景。本研究结果高于张法惺等[22]利用SSR分子标记对96份西瓜品种的遗传多样性(11.7%)，而低于Solmaz等[23]对土耳其不同区域的西瓜品种进行SSR标记的遗传多态率(100%)，这可能与西瓜材料来源的地域丰富程度有关。

本研究表明，32份供试西瓜种质资源的Na、Ne、H和I分别为1.7556、1.3929、0.2366、0.3614，遗传变异参数低于Mashilo等[24]对34份野生西瓜地方品种的SSR标记以及石磊等[25]对50份籽用西瓜种质资源的SSR分析结果，说明供试西瓜种质资源的遗传多样性丰富度不高，这可能与样本量少有关。不耐低温弱光种质资源(Na＝1.7111，Ne＝1.3658，H＝0.2186，I＝0.3337)比耐低温弱光种质资源(Na＝1.6333，Ne＝1.3395，H＝0.2046，I＝0.3117)遗传多样性丰富。耐低温弱光和不耐低温弱光两种类型供试小果型西瓜的遗传一致度为0.9340，遗传距离为0.0682，表明两种供试小果型西瓜亲缘关系较近。

通过UPGMA聚类比较将32份供试西瓜材料分为4大类。耐低温弱光小果型西瓜分布在Ⅰ、Ⅱ大类，不耐低温弱光小果型西瓜在4大类中均有分布。表明不耐低温弱光型的遗传多样性较耐低温弱光型丰富，这与前面遗传多样性参数结果一致。Cophentic相关性检验的遗传相似系数矩阵和UPGMA聚类结果矩阵间的相关系数为0.75，说明两者之间有密切的关联性，聚类结果准确。SSR分子标记结果表明，供试小果型西瓜间的亲缘关系较近，因此还需扩宽种质的遗传基础，引进新种质。本研究为揭示小果型西瓜种质资源间的亲缘关系和新品种选育提供了理论参考。