高粱GATA基因家族的全基因组鉴定及表达分析

宋迎辉，朱灿灿，代书桃，秦娜，王春义，张真，李君霞，平西栓

(1.河南省农业科学院粮食作物研究所，河南 郑州 450002；2.洛宁县农业技术推广服务中心，河南 洛宁 471700；3.河南省农业技术推广总站，河南 郑州 450002)

GATA转录因子是一种转录调节蛋白，包含一个典型的Ⅳ型锌指DNA结合域CX2CX17~20CX2C和一个后续保守区域，这类锌指的一些成员在基因的调控区域特异性地结合DNA序列(A/T)GATA(A/G)，从而调节基因的转录水平。从细胞黏菌到脊椎动物的生物体中都发现了该基因家族成员[1]。

Reyes等[2]对拟南芥和水稻的GATA家族基因进行研究发现，GATA家族基因DNA基序与光依赖和硝酸盐依赖的转录调控有关。真菌GATA因子调控氮代谢、光诱导、铁载体生物合成和配对类型转换[3]。旁系同源GATA转录因子GNC和CGA1/GNL受光、氮和细胞分裂素的调控，同时也受赤霉素信号的抑制[4]。在许多研究报道中对不同作物GATA转录因子家族进行了全基因组的鉴定分析，分别在拟南芥(Arabidopsis thaliana)[5]、水稻(Oryza sativaL.)[6]、大豆(Glycine max)[7]、棉花(Gossypium genus)[8]、甘蓝型油菜(Brassica napus)[9]、谷子(Setaria italica)[10]、番茄(Solanum lycopersicon)[11]、葡萄(Vitis viniferaL.)[12]、蓖麻(Ricinus communisL.)[13]和毛竹(Phyllostachys edulis)[14]中鉴定出了29、28、64、179、96、33、30、19、19、31个成员，为其在其他作物中的结构和生物学功能研究提供了参考。

高粱(Sorghum bicolor)是世界第五大禾谷类作物，广泛种植于全球干旱和半干旱地区。也是我国主要的杂粮作物之一，是传统酿造业，尤其是高端白酒酿造的主要原料。高粱具有光合效率高、抗旱耐涝、耐盐碱等诸多优良性状，同时也是研究甘蔗、玉米和柳枝稷等能源作物的重要模式作物[15]。2009年，高粱全基因组测序完成；2017年，高粱基因组序列得到进一步完善[16]，许多基因家族的鉴定和功能研究迅速展开[17－21]。但目前尚未见有关高粱GATA家族全基因组鉴定的报道。本研究利用分子生物学技术在全基因组水平上鉴定高粱GATA家族成员，并对其进行生物信息学分析，为探究高粱GATA家族基因功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 高粱GATA基因家族成员的鉴定

GATA基因家族典型锌指结构域种子序列(PF00320)从Pfam网站(http://pfam.xfam.org/)下载，并以PF00320的HMM模型为探针序列，利用HMMER 3.3软件搜索高粱基因组功能蛋白序列数据库，E值小于1×10－10。当同一基因对应多个蛋白序列时，仅保留氨基酸长度最长的序列作为GATA基因家族成员。进一步利用SMART(http://smart.embl.de/)在线工具验证GATA保守结构域的完整性，利用DNAMAN软件(https://www.lynnon.com)分析保守结构蛋白序列。利用ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)对最终筛选出的氨基酸序列进行在线分析，以确定蛋白的氨基酸长度、分子质量、等电点、疏水性平均值等理化特性。

1.2 高粱GATA家族基因的染色体分布

提取高粱GATA家族基因的已知基因组位置信息，利用Mapinspect软件绘制染色体分布图。

1.3 高粱GATA家族基因系统进化与基因结构分析

将所有的高粱GATA蛋白与从PlantTFDB网站下载的拟南芥、玉米和谷子GATA蛋白序列通过ClustalX 2.0软件进行多重序列比对，然后用MEGA 11.0软件以邻接法(Neighbor joining，NJ)构建进化树，Bootstrap replications设置为1 000，其他参数默认。

从数据库中提取鉴定到的GATA基因结构注释信息，利用GSDS(http://gsds.gao－lab.org/)在线软件分析高粱GATA基因的结构。

1.4 高粱GATA蛋白保守基序(Motif)分析

利用在线保守基序分析软件MEME(http://meme-suite.org/tools/meme/)进行Motif分析，参数中预测数目设置为8，其余均为默认设置。

1.5 高粱GATA基因启动子顺式调控元件分析

从NCBI基因组数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)获取每个SbGATA基因起始密码子上游2 kb序列，上传至PlantCARE服务器(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)搜索预测，分别统计每个SbGATA基因启动子检测到的顺式作用元件数量，利用MeV4.9软件绘制热图。

1.6 高粱GATA家族基因在不同组织中的表达模式分析

高粱不同组织中GATA转录组测序数据来自Phytozome(https://phytozome.Jgi.doe.gov/pz/)，用FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)值表示基因相对表达水平，利用MeV 4.9软件绘制热图。

1.7 干旱处理下的基因表达分析

选择常规种豫粱10号在温室中用Hoagland营养液进行水培，待幼苗长至三叶一心时，在处理中加入PEG6000模拟干旱处理，并分别于0、12、24、36 h取样，通过转录组测序的方法获得基因相对表达量，变化倍数用FC表示，用Log2FC表示基因相对表达量变化情况。

2 结果与分析

2.1 高粱GATA家族基因的鉴定、理化性质及染色体定位分析

经比对共鉴定出30个高粱GATA基因，根据其染色体位置分别命名为SbGATA1~SbGATA30。高粱GATA基因编码的氨基酸数量差异较大，最多可以编码547个氨基酸(SbGATA23)，最少编码125个氨基酸(SbGATA9)，平均编码345个氨基酸。高粱GATA基因编码蛋白分子质量在13 611.44~59 298.79 ku，平均为36 559.86 ku。等电点平均值为8.02，SbGATA4、SbGATA5、Sb-GATA11、SbGATA13、SbGATA16、SbGATA20、Sb-GATA26、SbGATA30等电点小于7.0，呈酸性；Sb-GATA2等电点约为7.0，接近中性；其余21个高粱GATA蛋白等电点大于7.0，呈碱性。不稳定系数50.54~80.91，均为不稳定蛋白(>40)；疏水性平均系数均为负数，表明高粱GATA蛋白均为亲水性蛋白(表1)。

表1 高粱GATA基因家族成员基本信息

30个高粱GATA基因家族成员不均匀地分布在8条染色体上，2号和7号染色体上无SbGATA基因分布(图1)。其中，1号染色体上的基因数量最多，有8个基因；其次是3、4、8、9号染色体，各有4个基因；5、6、10号染色体上各有2个基因。根据Holub[22]对基因簇的界定，本研究中30个SbGATA基因没有形成基因簇分布，说明串联重复不是SbGATA基因家族扩展的主要因素。

图1 高粱GATA基因在染色体上的分布

2.2 高粱GATA蛋白系统进化、保守序列分析

将鉴定到的高粱GATA基因家族成员氨基酸序列与拟南芥、玉米和谷子的GATA基因家族成员氨基酸序列进行比对(图2)，根据已知拟南芥GATA基因家族成员进化分类信息对高粱GATA基因家族进行分类(图3)，可将高粱GATA基因家族分为4组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，其中Ⅰ组包含15个家族成员，占总数的1/2，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别包含9、4、2个家族成员，同组内GATA成员之间蛋白序列一致性较高。Ⅲ组4个成员SbGATA3、SbGATA4、SbGATA18、SbGATA30的保守锌指结构域为CX2CX20CX2C，其他基因家族成员保守锌指结构域为CX2CX18CX2C；Ⅳ组两个成员SbGATA5和SbGATA20保守结构域蛋白序列完全一致。

图2 SbGATA蛋白家族保守序列比对分析

2.3 不同作物GATA蛋白系统进化分析

对4种不同作物的126个GATA基因家族成员，包括高粱30个、拟南芥29个、玉米36个和谷子31个，构建系统进化发育树，如图3所示，可将GATA基因家族分为4个分支，分支Ⅰ含有高粱GATA家族成员15个，拟南芥GATA家族成员14个，玉米GATA家族成员20个，谷子GATA家族成员15个；分支Ⅱ中高粱、拟南芥、玉米、谷子GATA家族成员分别为9、10、10、9个；分支Ⅲ含高粱和谷子GATA家族成员各4个，拟南芥、玉米GATA家族成员各3个；分支Ⅳ中高粱、拟南芥、玉米、谷子GATA家族成员分别为2、2、3、3个。

对4种作物GATA家族成员保守结构域分析发现，分支Ⅲ中全部GATA家族成员均为CX2CX20CX2C锌指结构，而其他分支GATA家族成员保守结构域为CX2CX18CX2C锌指结构。

除分支Ⅰ中SbGATA6和拟南芥GATA蛋白AT3G45170.1亲缘关系较近外，其他拟南芥GATA家族成员多单独聚为一类，表明高粱GATA家族基因与单子叶植物玉米和谷子GATA的亲缘关系较近，与双子叶植物拟南芥GATA的亲缘关系较远。

2.4 高粱GATA基因结构分析

高粱GATA家族基因含有1~8个外显子(图4)，其中Ⅰ组SbGATA13和SbGATA17含有1个外显子；SbGATA15、SbGATA19含有3个外显子，其他11个GATA基因含有2个外显子。Ⅱ组GATA基因含有2~3个外显子。Ⅲ组中SbGATA18含有3个外显子，SbGATA3、SbGATA4和SbGATA30含有7~8个外显子。Ⅳ组中SbGATA5和SbGATA20分别含有6个和8个外显子。说明同组中GATA家族成员基因具有很强的一致性。

图4 高粱GATA家族基因结构分析

2.5 高粱GATA蛋白的保守基序(Motif)分析

如图5所示，将鉴定的8个保守基序命名为Motif1~Motif8。Motif1为CX2CX18~20CX2C锌指结构域，所有高粱GATA蛋白均含有Motif1。同一组的高粱GATA家族成员具有相似的保守基序，除Motif1外，Ⅰ组中15个GATA家族成员均含有Motif2；Ⅱ组中9个家族成员只含有Motif1；Ⅲ组中SbGATA3、SbGATA4和SbGATA30含有Motif4和Motif7，SbGATA18含有Motif4的部分保守序列(结果未展示)；Ⅳ组中SbGATA5和SbGATA20均含有Motif5和Motif8。

图5 高粱GATA家族蛋白保守基序分析

2.6 高粱GATA顺式调控元件分析

如图6所示，鉴定到的胁迫相关顺式元件主要包括ABRE(脱落酸响应元件)、ARE(厌氧诱导响应元件)、CAT－box(分生组织表达)、CGTCAmotif(茉莉酸甲酯响应元件)、G－box(光响应元件)、LTR(低温响应元件)、MBS(干旱诱导响应元件)、O2－site(醇溶蛋白代谢调控元件)、RY－element(种子特异调控元件)、TC－rich(防御措施响应元件)、TCA－element(水杨酸响应元件)、WUNmotif(机械伤害响应元件)和circadian(昼夜节律控制元件)。

图6 高粱GATA家族基因顺式调控元件分析

多数高粱GATA家族成员都含有ABRE、ARE、CGTCA－motif和G－box元件。SbGATA2和SbGATA26中G－box和ABRE检测量高于其他家族成员，SbGATA5中未检测到ABRE和G－box，SbGATA6中未检测到ABRE，其他GATA家族成员中均至少有一个ABRE和G－box。SbGATA11检测到RY－element元件7个，SbGATA22中CATbox和SbGATA15中LTR分别检测到5个，明显高于其他家族成员。

30个SbGATA家族成员中共检测到492个主要顺式调控元件，其中，光响应元件G－box数量最多，共检测到116个；其次为ABRE，检测到105个；CGTCA－motif和ARE分别检测到70个和48个；CAT－box、LTR、MBS、O2－site、RY－element、TC－rich、TCA－element、WUN－motif、circadian分别检测到24、23、24、12、21、9、16、17、10个。表明高粱GATA家族基因可以响应低温、干旱、光强和光周期等多种逆境条件。

2.7 高粱GATA家族基因的表达分析

2.7.1 不同生长发育时期组织中的表达 由图7可知，Ⅰ组SbGATA19在各组织中无表达；SbGATA15在花分化期至成熟期下部叶片和叶鞘中表达量较高；SbGATA16除在幼苗期叶片、花分化期花序梗和成熟期干籽粒中表达量较低外，在其他组织中表达量均较高。Ⅱ组中SbGATA29在幼苗期和花分化期叶片中表达量较高；SbGATA9和Sb-GATA25除在圆锥花序、花序梗和干籽粒中表达量较低外，在其他组织中表达量均较高；SbGATA1和SbGATA12花分化期圆锥花序和花序梗中表达量较高。Ⅲ组中SbGATA30在成熟期干籽粒中表达量较高。Ⅳ组中SbGATA5和SbGATA20两个基因除在成熟期干籽粒中几乎无表达外，在其他组织中均有不同程度表达，SbGATA20在不同组织中表达量均较高。总体上，Ⅲ组和Ⅳ组中SbGATA基因家族成员表达量较高。表达分析表明SbGATA基因家族在高粱生长发育中发挥着重要作用。

图7 高粱GATA家族基因在不同生长发育时期组织中的表达分析

2.7.2 干旱胁迫下的表达 转录组分析发现，只有当高粱幼苗模拟干旱处理36 h时，与对照相比，SbGATA11和SbGATA26上调表达，其他时间段其他GATA家族基因表达无差异，说明SbGATA11和SbGATA26基因可能在高粱响应干旱胁迫时发挥重要作用(图8)。

图8 高粱GATA家族基因在干旱处理下的表达分析

3 讨论与结论

本研究从高粱基因组中鉴定出30个GATA成员，其中，26个蛋白序列包含CX2CX18CX2C锌指结构域，与拟南芥[23]和水稻[24]等作物的研究结果一致，而SbGATA3、SbGATA4、SbGATA18和Sb-GATA30的保守锌指结构域为CX2CX20CX2C。这些基因不均匀地分布在8条染色体上，1号染色体上基因数最多(8个)，2号、7号染色体上未鉴定到SbGATA基因。

SbGATA蛋白均为不稳定的亲水蛋白，有21个呈碱性，8个呈酸性；编码125~157个氨基酸，

分子质量13 611.44~59 298.79 ku。这些差异可能使其具有不同的生物功能。系统进化分析发现，高粱GATA家族成员可分为4组，与单子叶植物玉米和谷子的GATA亲缘关系较近，与双子叶植物拟南芥的GATA亲缘关系较远；同一组的SbGATA基因结构和蛋白保守基序一致性高，而不同组的SbGATA基因外显子数量差异较大，UTR结构长度差异明显。

SbGATA蛋白含有多种顺式作用元件，可以调控对低温、干旱、厌氧、光强和光周期等非生物胁迫的响应，并参与调控脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸等激素信号传导。部分基因在分生组织表达、醇溶蛋白代谢调控、防御措施响应、机械伤害响应及种子特异调控元件有响应位点，但不能说明都可以有效结合并影响表达，而且调控方向未明。

表达分析发现，SbGATA15在花分化期至成熟期下部叶片和叶鞘中表达量较高；SbGATA29在幼苗期和花分化期叶片中表达量较高；SbGATA1和SbGATA12在花分化期圆锥花序和花序梗中表达量较高；SbGATA30在成熟期干籽粒中表达量较高；SbGATA16、SbGATA9、SbGATA25和SbGATA20在多数组织中表达量均较高。Zhang等[25]在水稻中发现一个GATA转录因子，可以增加水稻耐冷性，在所有组织中均有表达，在圆锥花序中表达量最高。本研究也发现多个SbGATA基因有低温响应位点，SbGATA16和Ⅲ组、Ⅳ组的6个基因在圆锥花序中表达量较高。马铃薯GATA基因的组织定位研究也发现，StGATA9基因主要表达于叶维管束的韧皮部和茎维管束系统[26]，StGATA12基因在马铃薯根、茎、花和叶中均有表达，在花中的表达量最高[27]。卢成达等[10]研究发现，谷子GATA家族成员可以响应干旱胁迫、缺氧胁迫、光强及光周期等多种逆境条件，参与生长素、赤霉素、水杨酸等激素信号传导调控。玉米GATA家族成员在热胁迫处理后，表达上调的基因有9个，可能在应答热胁迫过程中发挥重要作用[28]。以上研究说明GATA转录因子对植物的抗逆性调控具有重要作用，进一步研究高粱GATA基因功能，对充分了解高粱抗逆性及抗逆育种都具有重要意义。