血浆长链非编码RNA H19对乳腺癌新辅助治疗效果的预测价值

陈安莉，沈浩元，阳仕雄，邓春燕，胡超华，刘汉忠，王 舒，钱 芳

1.锦州医科大学孝感市中心医院研究生培养基地，湖北 孝感 432000；

2.武汉科技大学附属孝感医院（孝感市中心医院）甲状腺乳腺外科，湖北 孝感 432000；

3.武汉科技大学附属孝感医院（孝感市中心医院）中心实验室，湖北 孝感 432000；

4.武汉科技大学附属孝感医院（孝感市中心医院）儿科，湖北 孝感 432000；

5.武汉科技大学附属孝感医院（孝感市中心医院）病理科，湖北 孝感 432000

根据国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）2020年全球癌症统计，乳腺癌的发病率（11.7%）已经超过肺癌（11.4%）而成为全球最常见的恶性肿瘤，同样也是女性人群中主要的癌症死因［1］。乳腺癌新辅助治疗由于可增加降期、保乳、保腋窝的概率，同时还可筛选高危人群、获得药物敏感性的信息指导后续用药，因此新辅助治疗已成为早期乳腺癌的重要治疗策略［2］。即使随着新辅助治疗、内分泌治疗、分子靶向治疗的进展，部分早期乳腺癌患者的预后获得了明显改善，但复发、转移及耐药等一系列预后不良的因素成为了乳腺癌死亡率高的原因。因此，深入研究乳腺癌早期诊断方法，探寻更准确的新辅助治疗的生物标志物用于乳腺癌早期诊断及后续治疗药物的选择已成为目前亟待解决的问题。部分乳腺癌患者对新辅助治疗并不敏感［3］，寻找在新辅助治疗前可以预测新辅助治疗效果的因素对于乳腺癌治疗有着非常重要的意义。

乳腺癌的发生、发展过程中常伴随着遗传及表观遗传学的变化，近年来研究［4-6］表明长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在肿瘤的发生、发展、远处转移及耐药过程中充当重要角色，可以在基因组表观遗传、转录及转录后水平等多个层面发挥调控作用，H19是常见的肿瘤相关lncRNA，目前已证实lncRNA H19在乳腺癌组织及乳腺癌患者血浆中均有较高的表达［7-9］。LncRNA H19参与乳腺肿瘤形成的过程受到缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α、p53、E2F1 等因素调节，影响细胞周期进程，促进细胞增殖与转移［10］。基于lncRNA H19与乳腺癌新辅助治疗具有一定相关性，本研究通过动态检测乳腺癌患者新辅助治疗前，新辅助治疗2、4和6个周期，以及手术后外周血lncRNA H19的表达水平及变化情况，分析血浆lncRNA H19的动态变化对不同分子分型乳腺癌新辅助治疗效果的预测及患者预后的影响。

1 资料和方法

1.1 一般资料

前瞻性选取2020年1月—2021年12月武汉科技大学附属孝感医院（孝感市中心医院）甲乳外科收治的45例行新辅助治疗的乳腺癌患者为研究对象。年龄34～ 61岁，平均年龄（47.00±8.07）岁，均为女性患者，所纳入的病例新辅助治疗前均在彩色超声下行空芯针穿刺活检明确病理学类型，肿瘤负荷大小及临床分期根据美国癌症联合会（American Joint Cancer Committee，AJCC）第8版TNM分期，T2期有25例，T3～ T4期有20例。确诊后治疗方案根据患者的分子分型及TNM分期等状态进行个体化选择，包括蒽环类、紫杉类及铂类药物的方案联合或序贯治疗，人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阳性患者给予抗HER2治疗。

1.2 纳入及排除标准

纳入标准：①初治女性乳腺癌患者，组织病理学检查结果为乳腺癌；② 年龄20～ 70岁；③符合新辅助治疗指征且至少完成6个周期新辅助治疗；④ 具备完整的临床信息；⑤ 既往未因乳腺癌接受过任何治疗。排除标准：①合并严重脏器功能障碍；② 合并精神类疾病；③不符合新辅助治疗适应证；④ 中途放弃新辅助治疗者；⑤有远处器官转移者；⑥ 一般情况差，不能耐受治疗及手术者。

1.3 标本收集

所有患者分别在新辅助治疗前、新辅助治疗2、4和6个周期及手术后以促凝管留取患者空腹血4 mL，2 000 r/min、离心半径10 cm、离心15 min，吸取上层血清至1.5 mL无酶离心管中，使用前均保存于-80 ℃超低温冰箱。本研究收集样本均取得患者知情同意，并获得武汉科技大学附属孝感医院（孝感市中心医院）伦理委员会批准。

1.4 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）测定乳腺癌外周血血浆中lncRNA H19的表达

采用QIAzol Lysis Reagent提取血浆中的RNA（具体见试剂盒说明书）。利用 SYBR Green荧光染料试剂盒、Step One Plus™Q-PCR仪进行RTFQ-PCR（购自美国ABI公司）以检测lncRNA表达水平。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）作为内参，反应条件按照说明书进行。H1 9 上游引物为5'-GAGTCGGCACACTATGGCT-3'，下游引物为5'-GCTGGGTAGCACCATTTCTTTC-3'；GAPDH上游引物为5'-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3'，下游引物为5'-GCGCGGCGATATCATCATC-3'。2-ΔΔCt法计算lncRNA相对表达水平，其中ΔCt=CtLncRNA-CtGAPDH。

1.5 新辅助治疗后疗效评价

①依据世界卫生组织制定的实体瘤疗效评价标准（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST）1.1版本进行疗效评估：完全缓解（complete response，CR）为所有靶病灶消失，无新病灶出现，且肿瘤标志物正常，至少维持4周；部分缓解（partial response，PR）为靶病灶最大径之和较少≥30%，至少维持4周；疾病进展（progressive disease，PD）为靶病灶最大径之和增加≥20%或者出现新病灶；疾病稳定（stable disease，SD）为靶病灶最大径之和缩小未达PR，或者增大未达 PD。② 在本研究中，病理学完全缓解（pathological-complete-response，pCR）被定义为乳腺及腋窝淋巴结内无浸润性癌成分。病理学不完全缓解（non-pathologicalcomplete-response，non-pCR）定义为由于部分肿瘤反应，任何阳性淋巴结或浸润性癌残留在乳腺中。

1.6 观察指标

①乳腺癌患者外周血血浆中lncRNA H19的表达水平；② 乳腺癌患者新辅助治疗前，治疗2、4及6个周期，以及手术后外周血血浆中lncRNA H19表达量的动态变化；③新辅助治疗的疗效与新辅助治疗前及2个周期后血浆中lncRNA H19的表达水平的关系；④ 不同分子分型乳腺癌患者新辅助治疗前血浆中lncRNA H19的表达量的差异；⑤ 乳腺癌患者血浆中lncRNA H19的表达水平与肿瘤负荷及残余肿瘤负荷、淋巴结状态及TNM分期的关系；⑥ 血浆中lncRNA H19评估新辅助疗效的价值。

1.7 统计学处理

采用SPSS 26.0和Graphpad prism 9.0统计学软件进行统计分析。采用单因素方差分析（Oneway ANOVA）评估lncRNA H19在新辅助治疗过程中的动态变化；多因素采用多因素方差分析（Two-way ANOVA）进行检验；计量资料用表示，组间比较采用样本t检验。根据lncRNA H19的表达水平及新辅助治疗是否有效绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者基线特征

纳入患者均为女性，年龄34～ 67岁，平均49.9岁。绝经前25例，绝经后20例。临床分期中，T2期19例，T3-4期26例；N0期15例，N1期25例，N2期5例；TNM 分期中，ⅡA期6例，ⅡB期17例，ⅢA期17例，ⅢB期5例。分子分型中，激素受体阳性型（luminal型）、HER2阳性型和TNBC各15例（表1）。

2.2 不同时期乳腺癌患者lncRNA H19表达量的变化

入组的乳腺癌患者新辅助治疗前后的各个时间段血浆lncRNA H19的表达水平均有差异，分析血浆H19的表达水平在新辅助治疗过程中的动态变化时，结果显示绝大多数乳腺癌患者在新辅助治疗第2个周期后血浆H19水平有明显下降，且新辅助治疗2及4个周期后、手术前及手术后的表达较新辅助治疗前均有显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中45例乳腺癌患者中在新辅助治疗第2个周期后有29例患者较新辅助治疗前下降，而16例患者反而有上升的趋势。同时，本研究也显示新辅助治疗可降低大多数乳腺癌患者血浆H19的表达（图1）。

2.3 乳腺癌患者不同情况下与血浆中lncRNA H19的表达量的关系

本研究结果显示，肿瘤负荷大的乳腺癌患者血浆lncRNA H19的表达水平较肿瘤负荷小者稍高，但差异无统计学意义（P＞0.05）；同样对比新辅助治疗后残余肿瘤负荷与血浆H19的表达可见，肿瘤残余大小≤2 cm的患者血浆H19表达量显著高于＞2 cm患者，差异有统计学意义（P=0.001）。术后残余肿瘤大小与新辅助治疗前血浆中H19相对表达量呈负相关，淋巴结状态N0和N1患者血浆H19表达量均显著高于N2患者，这可能都预示着血浆H19表达高的患者更能获益。从TNM分期中可见ⅡA期与ⅡB期（P＜0.001）、ⅡB期与ⅢA期（P=0.048）及ⅢA期与ⅢB期（P＜0.001）差异均有统计学意义（图2）。

2.4 不同分子分型乳腺癌患者血浆中lncRNA H19的表达量的差异

对比不同分子分型乳腺癌患者血浆中lncRNA H19表达水平的动态变化时，发现HER2+和激素受体阳性（luminal型）乳腺癌患者在新辅助治疗后lncRNA H19表达均有下降的趋势，而TNBC大多数患者在新辅助治疗第2个周期后不降反升；此外，本研究发现新辅助治疗前HER2+乳腺癌患者血浆H19表达量显著高于TNBC（P=0.003），较激素受体阳性乳腺癌有数值上提高，但差异无统计学意义（P＞ 0.05）。对不同分子分型患者在新辅助治疗前H19水平进行两两比较时发现，TNBC患者显著低于luminal型（P=0.037）。在新辅助治疗2个周期后有16例患者的血浆H19水平较治疗前有所升高，其中12例为TNBC，4例为HER2+型，对比3种分子分型在新辅助治疗2个周期后H19的变化情况，结果差异无统计学意义（P＞0.05，图 3、4）。

2.5 乳腺癌患者血浆中LncRNA H19的表达量与新辅助治疗效果的相关性

乳腺癌患者新辅助治疗后，pCR为20例（44.4%），non-pCR为25例（55.6%）。在观察血浆中lncRNA H19的表达量与新辅助治疗的预后关系时，pCR组的H19表达随着新辅助治疗的进行均有明显下降的趋势（P＜0.05），而nonpCR组的H19表达水平在新辅助治疗后又升高，且随着新辅助治疗的进行H19表达水平波动起伏不定，差异无统计学意义（P＞0.05）。pCR组在新辅助治疗前血浆中lncRNA H19的相对表达量显著高于non-pCR组（P=0.001）；此外，达到CR组患者新辅助治疗前H19水平高于PR组（P=0.079）和SD组（P=0.187，图4）。

2.6 血浆中lncRNA H19评估新辅助疗效价值的评估

根据乳腺癌患者血浆lncRNA H19表达水平绘制ROC曲线，确定约登指数（灵敏度+特异度-1），用于确定截断值。ROC曲线分析结果显示，在区分新辅助治疗是否达到pCR，H19的曲线下面积（area under the curve，AUC）为 0.70，灵敏度为100%，特异度为50%（图5）。

3 讨 论

新辅助治疗已经成为早期乳腺癌及局部晚期乳腺癌最佳治疗模式，以及大多数Ⅱ、Ⅲ期TNBC与HER2阳性乳腺癌的优选治疗模式。研究表明新辅助治疗后达到pCR的患者可比未达到pCR者获得更长的生存期，提前观察到肿瘤细胞对治疗药物的敏感性，可能使患者避免无效的药物治疗，有利于后续的手术治疗及减少术后的复发［11］。然而，部分患者在接受新辅助治疗后预后不佳，甚至失去了局部治疗的机会，因此，寻找可以预测新辅助治疗效果的生物标志物可以有效地提高乳腺癌患者的预后及生存率。

人类基因组中经转录而成的RNA中仅有2%具有编码蛋白质功能，而不具有编码蛋白质功能的RNA称为非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）［12］。LncRNA 是近年来发现的一类长度大于200 nt的RNA分子，其在肿瘤的发生、发展、转移及耐药过程中充当重要角色，并在许多恶性肿瘤中表现出较高的组织特异性［10，13］。研究［14-15］表明，许多lncRNA的表达谱与乳腺癌的不良预后、治疗及靶向治疗耐药、生存率和疾病复发相关。LncRNA在乳腺癌中的表达水平有望用于预测新辅助治疗效果，也有望作为乳腺癌的生物标志物，可能有助于早期乳腺癌的诊断和提高疾病治疗效果。

LncRNA H19通过多种机制参与乳腺癌的发生、发展，包括编码miR-675、参与竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）调控网络、与Myc相互作用等［16］。一项分析结果表明，lncRNA H19在癌症检测和诊断方面具有相对中等的准确性［7］。

Zhang等［9］的研究显示相对于健康人群，乳腺癌患者外周血中的lncRNA H19表达水平更高（P＜0.05），且经手术治疗后外周血中H19水平呈显著下降的趋势（P=0.001），这与本研究证实的手术后H19表达量较新辅助治疗前显著下降的结果相一致。此外，有研究［8］分析了行新辅助治疗乳腺癌患者3种lncRNA（lncRNAs H19、MALAT1和GAS5）在血浆中的表达水平对新辅助治疗的影响，结果仅发现H19与乳腺癌新辅助治疗效果相关，进一步支持本研究，且在该研究显示在新辅助治疗4个周期后血浆H19表达水平较新辅助治疗前呈下降的趋势，这与本研究结果一致，达到pCR的患者新辅助治疗前H19水平低于non-pCR患者（P=0.040），不同分子分型H19表达水平差异无统计学意义。本研究发现，HER2+乳腺癌患者血浆H19表达量高于激素受体阳性乳腺癌和TNBC（P=0.020），且达到pCR的患者新辅助治疗前H19水平显著高于non-pCR患者（P＜0.05），这与上述研究结果有差异，可能因为本研究发现HER2+型乳腺癌患者血浆H19表达量显著较高。后续我们将扩大样本量继续探索lncRNA H19在不同分子分型乳腺癌患者新辅助治疗中的动态变化及其与临床病理学特征的关系。

本研究发现，血浆中lncRNA H19表达水平与新辅助治疗肿瘤负荷无显著相关性，而与术后残余肿瘤负荷相关（P＜0.05），这可能也提示血浆H19水平高的患者与更好的预后有关。

HER2+乳腺癌患者血浆H19表达量显著高于其他亚型，血浆中的lncRNA H19表达量与新辅助治疗有显著相关性，且下降更明显的患者更容易达到pCR，可作为预测不同分子亚型新辅助治疗效果的潜在预测因子。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。