基于EP2/ NLRP3 信号通路探讨雀啄灸对原发性痛经大鼠的影响

胡 静 卫 弯 高 慧 徐 刚 杨华元

上海中医药大学针灸推拿学院，上海 201203

原发性痛经（primary dysmenorrhea，PD）又称功能性痛经，是伴随月经出现的非器质性下腹及腰部痉挛性疼痛，发病率为20%～94%，是困扰全球女性最常见的妇科疾病[1]。艾灸对PD 的临床近期治愈率达90%[2]，疗效显著且无明显副作用，雀啄灸作为一种动态悬灸，可提供比温和灸更强的热刺激[3]，经临床验证对PD 有较好的镇痛效果[4]。但灸法治疗PD 的机制尚不清楚。Nod 样受体蛋白3（Nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎症体是炎症反应的核心[5]，研究发现在PD 大鼠子宫中存在NLRP3 异常活化现象[6]。前列腺素E 受体2（prostaglandin E receptor 2，EP2）可通过下游信号通路促进NLRP3 的活化[7-8]，引起下游效应蛋白caspase-1明显升高，加重炎症反应。而灸法治疗PD 的抗炎机制是否与调控EP2/NLRP3 信号通路有关尚无文献报道。因此，本研究通过给予EP2 受体激动剂探究雀啄灸对痛经大鼠子宫EP2/NLRP3 信号通路的调控作用，阐明灸法通过抗炎治疗PD 的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

清洁级雌性SD 大鼠，3 月龄，体重（200±20）g，由上海中医药大学动物实验中心提供，动物合格证号：20180006028619，生产许可证号：SCXK（沪）2018-0006，伦理审查号：PZSHOTCM210604005。将24 只处于动情间期的SD 大鼠按照随机数字表法分为空白组、模型组、雀啄灸组、激动剂组，每组6 只。

1.2 主要试剂及仪器

苯甲酸雌二醇注射液（宁波第二激素厂，1102525 11）；缩宫素注射液（上海禾丰制药厂，120302）；Treprostinil（CSNpharm，CSN23716-001）；EP2 一抗（Abcam，Ab236779）；NLRP3 一抗（Bioss，bs-10021R-AF555）；caspase-1 一抗（Bioss，bs-10743R）；广谱二抗（上海长岛生物技术有限公司，D-3004）。光学显微镜（OLYM PUS，CH30 型）；恒温烘箱（上海恒一科学仪器有限公司，DHG-9023A）；石蜡切片机（徕克公司，SQ2125）；显微图象分析系统（NIKON 公司，DS-Ri2）。

1.3 造模方法

参考《常用医药研究动物模型》[9]建立大鼠PD 模型。除空白组外，其余三组大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇：第1、10 天剂量为0.5 mg/只，第2～9 天剂量为0.2 mg/只。在第10 天，注射苯甲酸雌二醇1 h 后大鼠腹腔注射缩宫素2 U/只。空白组每日注射同等剂量的生理盐水。注射缩宫素后出现扭体反应作为模型成功的标志[10]。

1.4 治疗方法

空白组：每日注射生理盐水后不进行任何处理；模型组：每日造模后不进行任何处理；雀啄灸组：每日造模后，选取双侧三阴交和关元穴进行雀啄灸治疗，每穴15 min，1 次/d，共10 次；激动剂组：每日造模后，腹腔注射Treprostinil（EP2 受体激动剂）30 μg/kg，之后进行雀啄灸治疗，治疗方法同雀啄灸组。

1.5 观察指标

1.5.1 大鼠扭体次数 造模第10 天，各组大鼠腹腔注射缩宫素后观察30 min，记录扭体潜伏时间、扭体次数。

1.5.2 子宫组织HE 染色 各组子宫组织脱蜡水化后，使用苏木精染色5 min 后，经盐酸乙醇分色、自来水浸泡后，用伊红溶液染色2 min，经脱水、树胶封固后用显微镜观察。

1.5.3 子宫组织免疫组织化学法 每组随机选3 只检测EP2、NLRP3、caspase-1 蛋白表达，组织切片浸泡于二甲苯溶液中脱蜡，梯度乙醇浸泡后使用高压热修复法修复抗原，经H2O2孵育后用山羊血清封闭1 h，滴加一抗50 μl（稀释倍数1∶100），过夜孵育后滴加广谱二抗50 μl（稀释倍数1∶50），湿盒孵育后滴加ABC 50 μl，再用PBS 冲洗滴加LDAB 100 μl 染色，切片颜色变化时浸泡于苏木精中，用1%盐酸酒精组织分色，之后依次置于梯度乙醇、二甲苯中，用中性树胶封片。

1.6 统计学方法

采用GraphPad Prism 6 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验。以P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠扭体反应比较

与空白组比较，模型组大鼠扭体潜伏时间缩短、扭体次数增多（P ＜0.01）；与模型组比较，雀啄灸组潜伏时间延长、扭体次数减少（P ＜0.01）；与雀啄灸组比较，激动剂组潜伏期缩短、扭体次数增多（P ＜0.01）。见图1。

图1 各组大鼠扭体反应比较

2.2 各组大鼠子宫组织HE 染色观察

空白组子宫组织形态规则，肌细胞间质内少许淋巴细胞，无中性粒细胞浸润；模型组、激动剂组子宫小血管有扩张及充血表现，淋巴细胞与嗜酸性粒细胞等炎症细胞呈灶团样向外浸润明显；雀啄灸组间质内充血水肿及炎症细胞浸润程度明显较模型组减轻，肌壁间可见少许炎症细胞浸润，仅见少许小血管充血。见图2。

图2 各组大鼠子宫组织HE 染色（100×）

2.3 各组大鼠子宫组织中EP2、NLRP3、caspase-1 蛋白表达水平比较

与空白组比较，模型组EP2、NLRP3、caspase-1 蛋白表达升高（P ＜0.01）；与模型组比较，雀啄灸组EP2、NLRP3、caspase-1 蛋白表达降低（P ＜0.01）；与雀啄灸组比较，激动剂组NLRP3、caspase-1 蛋白表达升高（P <0.01），雀啄灸组与激动剂组EP2 蛋白表达比 较，差异无统计学意义（P >0.05）。见图3～4。

图3 各组大鼠子宫组织中EP2、NLRP3、caspase-1 蛋白表达水平比较

3 讨论

原发性痛经又称“经行腹痛”，由先天禀赋不足、情志失调、劳伤气血，外感风寒湿邪使气血瘀阻胞宫所致[11]。前列腺素是最为公认导致PD 发病的关键炎症介质，其中前列腺素E2与PD 关系十分密切[12-13]。前列腺素E2是体内含量最丰富的类花生酯脂质[14]，能产生广泛而持久的血管扩张作用和致痛作用。EP2 作为其受体与之结合后促使小血管扩张、增加微血管通透性、吸引中性粒细胞、加速炎症细胞浸润，协同其他炎症介质发挥致炎作用[15-16]。本研究结果显示，经雀啄灸治疗后大鼠痛经反应减轻，EP2 表达下降，子宫间质内充血水肿及炎症细胞浸润程度明显减轻，提示雀啄灸可以降低痛经子宫的炎症反应产生镇痛效应，与以往研究结果一致[17]。

图4 各组大鼠子宫组织中EP2、NLRP3、caspase-1 的蛋白表达（免疫组化染色，200×）

痛经患者促炎细胞因子基因编码上调，长期处于一种慢性微炎症状态[18]，但目前灸法治疗PD 的机制研究多集中于子宫微循环、血管活性物质、中枢神经系统等[19-21]，对雀啄灸的研究也局限于热源移动对粗神经纤维、胶状质细胞刺激产生镇痛效应[22]。PD 大鼠子宫NLRP3 炎症小体识别宿主体内危险信号后被激活[23-24]，而在多种疾病的炎症反应中EP2 可活化腺苷酸环化酶上cAMP/PKA 活性，激活核因子κB 促进NLRP3 炎症小体的活化进而激活白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）加重炎症反应[25-26]。因此，本研究立足于对EP2/NLRP3 的调控探讨灸法治疗PD 的抗炎机制。本研究结果显示，给予Treprostinil 后，子宫EP2 含量未发生明显变化，但NLRP3 及其下游caspase-1含量明显升高，子宫炎症细胞浸润程度有所增加。EP2激动剂可能干预了雀啄灸对NLRP3 炎症小体通路的抑制作用，与EP2 受体结合后引发其下游腺苷酸环化酶的活化，导致第二信使如环磷酸腺苷、游离钙离子水平升高，引起蛋白激酶A 活化，进一步激活NLRP3炎症小体，活化caspase-1，生成成熟的IL-1β，使细胞外信号转导入细胞内，从而扩张小血管，增加血管通透性使动脉扩张和微血管通透性增加导致局部水肿、疼痛。

本研究以炎症介质前列腺素受体为切入点，通过观察EP2、NLRP3 及其下游caspase-1 含量探讨雀啄灸的抗炎作用。首次证明了雀啄灸通过调控EP2/NLRP3 信号通路调节痛经大鼠炎症反应，阐明了雀啄灸治疗PD 的抗炎新机制，从不同角度补充了灸法治疗PD 的机制研究，为学者探讨针灸治疗PD 提供新的方法和思路。