尿素解离试验在减少新型冠状病毒抗体假阳性中的应用价值

李小凤，王 静，张海燕，薛成军，付 晓，罗 明，夏 云

WHO于2020年1月30日宣布新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019, COVID-19）疫情为国际关注的全球突发公共卫生事件，并于2020年2月28日将其风险程度评估从“高”上调至“非常高”[1]。此后，COVID-19在全球范围内出现大流行。目前，COVID-19的实验室诊断方法主要包括核酸检测、抗体检测和抗原检测3种。基于反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）技术的核酸检测方法是COVID-19诊断的金标准[2]，但采样部位、采样方式和病毒载量都会显著影响核酸检测的敏感度[3]。血清学试验可有效检测宿主针对病毒的免疫反应[4]，在一定程度上弥补核酸检测的不足，但该方法往往受到其他冠状病毒抗体或自身非特异性抗体潜在交叉反应的限制[5]。有研究发现，自身免疫性疾病（autoimmune diseases, ADs）患者血清的新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）抗体检测存在假阳性[6]。血清抗体检测出现假阳性结果通常是由于自身抗体、嗜异性抗体或血清中的补体等与检测试剂中的抗原非特异性结合所致。已有研究发现，尿素可作为抗原-抗体反应非特异性结合的解离物质[7]。本研究采用尿素对ADs患者的血清进行解离，评价其减少SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体假阳性结果的效果，同时探讨尿素解离试验对COVID-19确诊患者SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体检测结果的影响。现报告如下。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2020 年2月1日—2021年2月28日在重庆市公共卫生医疗救治中心和重庆医科大学附属第一医院就诊的350例患者和健康体检者作为研究对象，其中ADs患者（自免组）200例，纳入标准：①符合美国风湿病学会定义的ADs诊断标准[8-11]；②自身抗体阳性；③依据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第九版）》[12]的诊断标准，RT-PCR检测SARS-CoV-2核酸为阴性，无COVID-19的流行病学接触史、影像学及临床实验室指征。排除标准：①合并其他冠状病毒感染；②既往感染SARS-CoV-2或接种SARS-CoV-2疫苗的患者。COVID-19患者（COVID-19组）100例，其中发病时间≤7 d 35例、8～14 d 31例、≥15 d 34例，纳入标准：RT-PCR检测SARS-CoV-2核酸阳性。排除标准：①合并其他冠状病毒感染；②自身抗体阳性患者。健康体检者（健康组）50例，所有健康体检者RT-PCR 检测SARS-CoV-2核酸均为阴性。本研究经重庆市公共卫生医疗救治中心伦理委员会批准实施（批件号：2020-079-KY）。

1.2 试剂和仪器 胶体金免疫层析法SARS-CoV-2 IgM/IgG 抗体检测试剂盒购于英诺特生物科技有限公司。化学发光特异性SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体检测试剂盒和化学发光免疫分析仪均来自博奥塞斯公司。抗核抗体谱（IgG）检测试剂盒（欧蒙印迹法）购自德国欧蒙有限公司。SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒购自达安生物科技股份有限公司。尿素购自sigma公司。

1.3 SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体检测 采集自免组、COVID-19组与健康组静脉血，3500 rpm/min 离心10 min 后，取上层血清置于-80 ℃冰箱保存待测。采用胶体金免疫层析法检测3组的SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体，具体操作如下：向样本孔中加10 μl血清样本和2滴样本稀释剂，并在15～20 min内观察T线（测试线）和C线（质控线）中的结果，阳性判断标准：T线和C线位置同时出现肉眼可见的显色条带；弱阳性判断标准：C线位置出现肉眼可见的显色条带比T线位置出现的显色条带显著清晰；阴性判断标准：仅C线位置出现出现肉眼可见的显色条带。COVID-19组中胶体金免疫层析法SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体结果为弱阳性的标本，采用化学发光法复测SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体。SARS-CoV-2核酸检测采用RT-PCR技术。所有的检测均严格按照试剂和仪器说明书操作。

1.4 尿素解离试验 称取一定质量尿素，用磷酸盐缓冲液溶解配制不同浓度的尿素溶液（0、2、4、6、8、10 mol/L）待使用。所有SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体阳性标本均进行胶体金免疫层析法尿素解离试验，其中自免组SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体阳性标本采用不同浓度尿素进行解离，COVID-19组SARS-CoV-2 IgM/IgG阳性抗体标本采用6 mol/L尿素进行解离。COVID-19组中胶体金免疫层析法SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体结果为弱阳性的标本采用化学发光法复测后，进行尿素解离试验，尿素浓度采用6 mol/L。

1.5 统计学处理 应用SPSS 21.0统计软件分析处理数据，计量资料呈正态分布，采用±s 表示，组间比较采用F检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用四格表χ2检验或Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基本情况 自免组患者200例，包含50例系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）患者、50例干燥综合征（sjogren's syndrome, SS）患者、50例自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis, AIH）患者、50例混合性结缔组织病（mixed connective tissue disease, MCTD）患者。其中男性22例，女性178例，年龄范围19～87岁，平均年龄为（46.84±14.62）岁。COVID-19组患者100例，其中男性15例，女性85例，年龄范围23～78岁，平均年龄为（43.28±15.49）岁。健康组50例，其中男性5例，女性45例，年龄范围17～78岁，平均年龄为（43.20±15.90）岁，各组之间性别和年龄差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

表1 3组患者基本资料比较（±s）Table 1 Comparison of basic data in 3 groups (±s)

表1 3组患者基本资料比较（±s）Table 1 Comparison of basic data in 3 groups (±s)

注：*. F值

项目 COVID-19组(n=100) 自免组(n=200) 健康组(n=50) F/χ2值 P值年龄 (岁 ) 43.28±15.49 46.84±14.62 43.20±15.90 0.229* 0.797性别[例(%)]1.231 0.540男15(15) 22(11) 5(10)女85(85) 178(89） 45(90)

2.2 健康组和自免组SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体检测结果 健康组SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体特异度均为100%（50/50）。自免组SARS-CoV-2 IgM 和IgG抗体特异度分别为100%（200/200）和97%（194/200），其中6例SARS-CoV-2 IgG抗体阳性患者中，SLE患者3例，SS、MCTD和AIH患者各1例，且每例患者均存在抗核抗体（antinuclear antibody, ANA），其中2例患者仅ANA阳性，另外4例存在3种及以上自身抗体。

2.3 COVID-19组SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体检测结果 胶体金免疫层析法检测COVID-19组SARSCoV-2 IgM/IgG抗体的敏感度分别为56%（56/100）和77%（77/100），IgM/IgG抗体总敏感度为85%（85/100）。

2.4 尿素解离试验对ADs患者SARS-CoV-2 IgG抗体检测结果的影响 不同浓度尿素解离6例SARS-CoV-2 IgG抗体阳性的ADs患者血清结果显示：2 mol/L尿素解离后，1例SARSCoV-2 IgG抗体阳性者转为阴性；4 mol/L尿素解离后，2例SARS-CoV-2 IgG抗体阳性者转为阴性；6 mol/L、8 mol/L和10 mol/L尿素分别解离后，均有5例SARS-CoV-2 IgG抗体阳性者转为阴性，即6 mol/L为最佳尿素解离浓度，其特异度为99.5%（199/200）。见表2。

表2 不同浓度尿素解离对ADs患者SARS-Cov-2 IgG抗体检测结果影响Table 2 Effect of urea dissociation at different concentrations on the detection of SARS-CoV-2 IgG antibody in patients with ADs

2.5 尿素解离试验对COVID-19患者SARSCoV-2 IgM/IgG抗体检测结果的影响 COVID-19组中有36例患者SARS-CoV-2 IgG抗体呈弱阳性，6 mol/L尿素解离后，1例发病7 d内的患者SARS-CoV-2 IgG抗体转为阴性，弱阳性标本转阴率为2.78%（1/36），发病≥8 d的患者标本仍为阳性，SARS-CoV-2 IgG抗体弱阳性和阳性标本总体转阴率为1.30%（1/77）。COVID-19组患者中有38例患者SARS-CoV-2 IgM抗体呈弱阳性，18例呈阳性，均未出现转阴现象。胶体金免疫层析法检出的SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体弱阳性标本，经6 mol/L尿素解离前后，用化学发光法检测结果均为阳性。

3 讨 论

自2020年COVID-19的全球大流行已造成数亿人感染，并导致数百万人死亡。国家卫生健康委员会在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》[13]中首次提出COVID-19疑似病例具备血清SARS-CoV-2特异性 IgM抗体和IgG抗体阳性；血清SARS-CoV-2特异性IgG 抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期 4 倍及以上升高作为确诊病例。SARS-CoV-2特异性抗体血清学检测具有准确、方便的特点，可用于监测急性期COVID-19患者病情转归过程中的免疫状况，也可用于评估健康人接种COVID-19疫苗后产生抗体的情况[14-15]。因此排除SARS-CoV-2特异性抗体检测的干扰因素、消除假阳性，对COVID-19临床诊断和疫情防控具有重要意义。

已有研究显示，高类风湿因子（rheumatoid factor, RF）水平可能是导致SARS-CoV-2特异性抗体血清学检测假阳性的重要因素[16]。本研究检测200例ADs患者血清，SARS-CoV-2 IgM抗体均为阴性，6例SARS-CoV-2 IgG抗体为阳性，其中SLE患者3例，SS、MCTD和AIH患者各1例，与既往研究的结果一致[6]，说明自免组患者中容易出现SARS-CoV-2抗体假阳性问题。Aristov等[17]发现SARS-CoV-2棘突蛋白抗体和核蛋白抗体与线粒体、转谷氨酰胺酶、核抗原、甲状腺过氧化物酶、可提取核抗原和髓鞘碱性蛋白呈强反应性。同时，Aristov等[17]还发现5例血清SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体均为假阳性的非COVID-19患者标本中有3例ANA、肌动蛋白和线粒体抗体显著升高。由此推测，当人患ADs时，血液中的自身抗体与胶体金免疫层析法的硝酸纤维素膜包被的SARS-CoV-2抗原发生交叉反应是导致结果假阳性的可能原因。尿素作为一种解离剂，具有溶解和变性蛋白质的功能[18]。为寻找减少ADs患者假阳性结果的最佳尿素浓度，本研究采用不同浓度尿素对ADs患者SARS-CoV-2 IgG抗体阳性标本进行解离，结果发现随着尿素浓度增加，SARSCoV-2 IgG抗体转阴率在增加，但尿素浓度增加到6 mol/L、8 mol/L和10 mol/L时转阴率均为83.33%，本研究将尿素6 mol/L作为最佳解离浓度并用于后续实验，主要是基于有研究提示特异性抗原抗体亲和力随着尿素解离浓度的增加而降低[19]，因此，在同等效用下，选择浓度较低者作为最佳解离浓度。

Benner等[20]发现COVID-19患者在感染早期，SARS-CoV-2 抗体的亲和力较低，且随着感染持续时间的延长而增加。由于COVID-19患者在发病不同阶段其抗体的亲和力会有所不同[19]，而尿素解离的效果与抗原抗体的亲和力有关，由此推测尿素对各发病时期抗原抗体复合物的影响也可能有差异。本研究用尿素解离不同发病时间的COVID-19患者SARS-CoV-2 抗体阳性血清，发现1例发病7 d内患者SARS-CoV-2 IgG抗体由弱阳性转为阴性，可能原因是亲和力低，说明尿素对胶体金免疫层析法检测早期确诊患者抗体的敏感度可能存在一定的影响。张鹏等[21]发现化学发光法检测SARS-CoV-2抗体的检出率优于胶体金免疫层析法，因此本研究将尿素运用到化学发光法中去检测弱阳性标本，未发现SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体转为阴性。同时本研究存在一定的局限性，首先，纳入研究ADs和COVID-19患者数量较少，其次，未研究尿素解离试验减少SARSCoV-2特异性抗体假阳性结果的机制。

综上所述，采用尿素解离试验，可减少因抗原抗体交叉反应引起的假阳性问题，提高检测的特异度，但该方法可能会降低COVID-19确诊患者弱阳性SARS-CoV-2 IgG抗体的敏感度。