刺槐素对鞭毛蛋白诱导的小鼠骨髓巨噬细胞NLRC4 炎症小体活化的影响

王兆霞，补 娟，张晓玲，叶勒丹·马汉，吴选霞，周 玲

（1.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆维吾尔自治区人民医院，医学研究与转化中心，新疆 乌鲁木齐 830000）

NLRC4 炎症小体是一种参与炎症反应的多聚蛋白复合物，可通过识别病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）或内源性的损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）活化，进一步激活半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶-1（cysteine-aspartic proteases-1，caspase-1），促进白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）前体和白介素-18（interleukin-18，IL-18）前体切割为活性形成参与炎症反应。另一方面，caspase-1还可通过切割蛋白消皮素D（gasdermin D，GSDMD），释放N 端结构域并作用于细胞膜上，使其完整性丧失，引起细胞焦亡（pyroptosis）［1］。多项研究证明，NLRC4 炎症小体在如心肌梗死［2，3］，缺血性脑卒中［4］、糖尿病肾病［5］、哮喘［6］、结肠炎［7］、肺炎［8，9］等多种疾病中均发挥重要作用，因此抑制NLRC4 炎症小体的激活对治疗相关疾病具有重要临床意义。

刺槐素是一种黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、神经保护等作用，对缺血性脑卒中［10，11］、肺炎［12］、关节炎［13］、结肠炎［14］等炎症相关疾病均具有保护作用，抗炎抗氧化机制比较复杂。前期课题组研究发现刺槐素可抑制含NLR 家族Pyrin 域蛋白3（NLRP3）炎症小体的活化进而减少小鼠骨髓巨噬细 胞 中IL-1β 的 释 放［15］。NLRP3 炎 症 小 体 和NLRC4 炎症小体同属于NLR 家族，激活后可介导caspase-1 活化，促进IL-18 以及IL-1β 的成熟与分泌，参与炎症反应［16］。刺槐素是否能抑制NLRC4 炎症小体活化目前尚未见文献报道。本研究通过利用小鼠骨髓巨噬细胞BMDMs，鞭毛蛋白诱导NLRC4 炎症小体激活，通过检测Pro-caspase-1、Pro-IL-1β、IL-1β、IL-18 等相关因子，以此探讨刺槐素对NLRC4炎症小体的活化及细胞损伤的影响，为刺槐素的药理作用研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1材料 刺槐素（Acacetin）购自美国sigma 公司；鞭毛蛋白购自美国InvivoGen 公司；DMEM（高糖）培养基、PBS、0.25%胰蛋白酶溶液等均购自上海Excell Bio 公司；RIPA 裂解液购自Abcam 公司；IL-1β 酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、IL-18 ELISA 试剂盒购自杭州联科生物有限公司；caspase-1 抗体和IL-1β抗体购自美国Abcam 公司；LDH 试剂盒购自南京建成公司；荧光倒置显微镜购自日本尼康公司；蛋白电泳仪、化学发光成像仪、多功能酶标仪均购自美国BIO-RAD 公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠骨髓巨噬细胞（BMDMs）分离培养 选用体质量（25±5）g 的3 月龄C57BL/6 小鼠，购自新疆医科大学（许可证号：SCXK（新）2018-0002）。小鼠自由进食饮水，饲养环境为室温为21～25℃，相对湿度为50%～60%，通风良好。颈椎脱臼处死，分离出小鼠两侧股骨至超净台，分离肌肉，暴露骨质后从两端剪开，用注射器将骨髓细胞吹至50 mL 离心管，然后离心1 500 r/min，5 min。红细胞裂解液重悬，反复吹打，静置3 min 后加入含10%FBS 及1%双抗的DMEM 培养基混匀，1 500 r/min，5 min。用含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（10 ng/mL）的DMEM 培养基重悬。反复吹打使细胞混匀，然后将细胞悬液转移到培养皿，于37℃细胞培养箱培养。每天显微镜下观察细胞状态，呈长梭形，说明状态良好，开始后续实验。

1.2.2 细胞分组及培养 待细胞培养覆盖至80%培养皿时，将其分为4 组：对照组、LPS 组、LPS+鞭毛蛋白组和LPS+Acacetin+鞭毛蛋白组。对照组：给予BMDM 加入完全培养基；LPS 组：加入完全培养基，再加入LPS（50 ng/mL，3 h）；LPS+鞭毛蛋白组：加入完全培养及LPS（50 ng/mL，3 h），再加入鞭毛蛋白（10 μmol/L）刺激0.5 h；LPS+Acacetin+鞭毛蛋白组：加入完全培养基、LPS（50 ng/mL，3 h）及Acacetin（10 μmol/L）刺激0.5 h；再加入鞭毛蛋白（10 μmol/L）处理0.5 h。

1.2.3 蛋白质免疫印迹技术（western-blot，WB）检测pro-caspase-1、pro-IL-1β、caspase-1 和IL-1β 的表达水平 将离心后的无细胞上清转移至新的离心管中，加入等体积的甲醇和四分之一体积的氯仿，混匀，12 000 r/min 离心5 min，弃上清，再加入甲醇，离心5 min，弃上清，55℃金属浴干燥5 min 后备用；收集细胞样本，胰酶消化离心后，加入500 μL RIPA裂解液（已加入蛋白酶抑制剂），充分混匀，冰上放置40 min 后，12 000 r/min，4℃，离心15 min 收集上清备用。用BCA 法蛋白定量后取30 μg 进行SDSPAGE 电泳，湿转法将凝胶上蛋白转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上，在室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入抗体caspae-1（1∶1000）、IL-1β（1∶500）和β-actin（1∶1000），4℃摇床孵育过夜，TBST 水洗3 次，每次10 min，加入对应的稀释二抗溶液（1∶5000），室温下摇床孵育1 h，TBST 水洗3 次，每次10 min，增强化学发光剂（enhanced chemilum inescence，ECL）显色并用凝胶成像系统拍照。

1.2.4 ELISA 法 检 测 细 胞 上 清 中IL-1β、IL-18 和TNF-α 的含量 按照上述步骤处理细胞24 h，收集各组细胞的上清液，按照酶联免疫吸附试剂盒说明书 的 提 示 按 步 骤 检 测IL-1β、IL-18 和TNF-α 的水平。

1.2.5 乳酸脱氢酶（LDH）检测 收集每组细胞上清液，按照LDH 试剂盒说明书进行操作。酶标仪检测波长450 nm 吸光度值。1.3 统计学处理

采用SPSS21.0 统计学软件进行分析。各组实验数据以平均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 刺槐素对NLRC4 炎症小体活化的影响

Western blot 结果见图1，各组细胞裂解液中Pro-caspase-1、Pro-IL-1β 蛋白表达比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组相比，LPS+鞭毛蛋白组细胞上清液caspase-1、IL-1β 的表达量明显上调，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与LPS+鞭毛蛋白组相比，LPS+Acacetin+鞭毛蛋白细胞上清液caspase-1、IL-1β 的表达量明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1、2。

图1 刺槐素对鞭毛蛋白诱导的巨噬细胞的Pro-caspase-1、Pro-IL-1β、caspase-1、IL-1β 蛋白水平的影响Fig 1 Effect of Acacetin on expression of Pro-caspase-1，Pro-IL-1β，caspase-1，IL-1β protein in flagellin-induced macrophage inflammatory

表1 刺槐素对鞭毛蛋白诱导的巨噬细胞裂解液中Pro-caspase-1、Pro-IL-1β 蛋白水平的影响（n=3，±s）Tab 1 Effect of Acacetin on expression of Pro-caspase-1，Pro-IL-1β protein in flagellin-induced macrophage lysate（n=3，±s）

表1 刺槐素对鞭毛蛋白诱导的巨噬细胞裂解液中Pro-caspase-1、Pro-IL-1β 蛋白水平的影响（n=3，±s）Tab 1 Effect of Acacetin on expression of Pro-caspase-1，Pro-IL-1β protein in flagellin-induced macrophage lysate（n=3，±s）

组别对照组LPS 组LPS+鞭毛蛋白组LPS+Acacetin+鞭毛蛋白组FP Pro-caspase-1 0.685±0.015 0.656±0.081 0.694±0.090 0.666±0.057 0.197 0.896 Pro-IL-1β 0.820±0.050 0.823±0.050 0.864±0.016 0.873±0.052 1.142 0.389

表2 刺槐素对鞭毛蛋白诱导的巨噬细胞上清液中caspase-1、IL-1β 蛋白水平的影响（n=3，±s）Tab 2 Effect of Acacetin on expression of caspase-1，IL-1β protein in flagellin-induced macrophage supernatant（n=3，±s）

表2 刺槐素对鞭毛蛋白诱导的巨噬细胞上清液中caspase-1、IL-1β 蛋白水平的影响（n=3，±s）Tab 2 Effect of Acacetin on expression of caspase-1，IL-1β protein in flagellin-induced macrophage supernatant（n=3，±s）

注：与对照组比较，△P＜0.05；与LPS 组比较，▲P＜0.05；与LPS+鞭毛蛋白组比较，◇P＜0.05。

组别对照组LPS 组LPS+鞭毛蛋白组LPS+Acacetin+鞭毛蛋白组FP caspase-1 0.153±0.010 0.174±0.009 0.505±0.020△▲0.352±0.080△▲◇47.3＜0.00 01 IL-1β 0.066±0.005 0.073±0.004 0.411±0.030△▲0.189±0.029△▲◇174.2＜0.00 01

2.2 刺槐素对鞭毛蛋白诱导的小鼠骨髓巨噬细胞炎性因子释放的影响

与对照组比较，LPS+鞭毛蛋白组细胞上清液IL-1β、IL-18 和TNF-α 的表达量上调（P＜0.05）；与LPS+鞭毛蛋白组相比，LPS+刺槐素+鞭毛蛋白组细胞上清液IL-1β 的表达量下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；IL-18 和TNF-α 的表达量下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）见表3。

表3 刺槐素对鞭毛蛋白诱导的巨噬细胞的上清液中IL-1β、IL-18 和TNF-α 水平的影响（pg/mL，n=3，±s）Tab 3 Effect of Acacetin on expression of IL-1β，IL-18 and TNF-α protein in flagellin-induced macrophage supernatant（pg/mL，n=3，±s）

表3 刺槐素对鞭毛蛋白诱导的巨噬细胞的上清液中IL-1β、IL-18 和TNF-α 水平的影响（pg/mL，n=3，±s）Tab 3 Effect of Acacetin on expression of IL-1β，IL-18 and TNF-α protein in flagellin-induced macrophage supernatant（pg/mL，n=3，±s）

注：与对照组比较，△P＜0.05；与LPS 组比较，▲P＜0.05；与LPS+鞭毛蛋白组比较，◇P＜0.05。

组别对照组LPS 组LPS+鞭毛蛋白组LPS+Acacetin+鞭毛蛋白组FP IL-1β 47.735±1.265 85.443±42.909 1 519.461±56.019△▲656.763±57.439△▲◇6 884.1＜0.000 1 IL-18 1.294±0.686 1.942±1.452 11.291±0.349△▲10.293±1.197△▲82.13＜0.000 1 TNF-α 19.346±14.528 1 558.217±67.179△2 978.403±58.542△▲2 811.843±245.629△▲329.1＜0.000 1

2.3 刺槐素对鞭毛蛋白诱导的小鼠骨髓巨噬细胞损伤的影响

与对照组相比，LPS 组的LDH 活性显著升高，LPS+鞭毛蛋白组LDH 的活性则升高更明显（P＜0.05），与LPS+鞭毛蛋白组相比，LPS+Acacetin+鞭毛蛋白组LDH 活性明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 刺槐素对鞭毛蛋白诱导的巨噬细胞上清液中LDH 活性的影响（U/L，n=3，±s）Tab 4 Effect of Acacetin on the activity of LDH in flagellininduced macrophage supernatant（U/L，n=3，±s）

表4 刺槐素对鞭毛蛋白诱导的巨噬细胞上清液中LDH 活性的影响（U/L，n=3，±s）Tab 4 Effect of Acacetin on the activity of LDH in flagellininduced macrophage supernatant（U/L，n=3，±s）

注：与对照组比较，△P＜0.05；与LPS 组比较，▲P＜0.05

组别对照组LPS 组LPS+鞭毛蛋白组LPS+Acacetin+鞭毛蛋白组FP LDH 活性216.993±31.698 785.621±135.412△1 671.896±143.571△▲1 452.288±88.937△▲109.6＜0.000 1

3 讨论

NLRC4 炎症小体是参与免疫应答的重要的感受器，可引起炎症反应和细胞焦亡。多项研究证明，NLRC4 炎症小体在多种炎症相关疾病中扮演重要角色，因此抑制NLRC4 炎症小体的活化可能是治疗炎症相关疾病的潜在靶点。Ahn 等［17］在细胞实验发现，金丝桃苷可通过减少IL-18、IL-1β 和caspase-1 的分泌，抑制NLRC4 炎症小体的激活；Ahn等［18］通过骨髓巨噬细胞实验发现，亚甲蓝可剂量依赖性地抑制鞭毛蛋白介导的IL-1β 和caspase-1 的分泌，说明亚甲蓝可抑制NLRC4 炎症小体的激活，从而发挥抗炎作用；Hou 等［19］研究发现，蓝萼甲素可减少caspase-1 和IL-1β 的成熟和分泌，通过抑制NLRC4 炎症小体活化发挥抗炎作用。

刺槐素（Acacetin）又称刺槐黄素、阿卡西汀、金合欢素，是一种黄酮类化合物，多个研究证实刺槐素具有抗炎作用。如Wu 等［20］通过在小鼠体内体外实验中发现，刺槐素可通过减少肺组织中的TNF-α和IL-1β 的释放，抑制活性氧的产生，减轻肺组织水肿，从而保护LPS 诱导的细胞损伤；Ren 等［14］研究发现，刺槐素可通过使NO、IFN-γ、iNOS 的分泌减少，IL-1β、TNF-α、IL-6 的表达下调，进而减轻结肠黏膜结构的破坏、溃疡和炎症浸润，使体重减轻，出血性腹泻和结肠长度缩短等症状减轻，从而对溃疡性结肠炎发挥保护作用；郑建君等［11］通过动物实验研究发现，刺槐素可通过抑制TGF-β1、Smad3 mRNA 和蛋白的表达，抑制TGF-β1/Smad3 信号通路，对急性脑梗死大鼠表现出较强的神经保护作用。

本研究通过用BMDMs 细胞实验，利用鞭毛蛋白刺激小鼠骨髓巨噬细胞来激活NLRC4 炎症小体，探讨刺槐素对NLRC4 炎症小体活化的影响。研究结果显示，LPS 组上清液中成熟的caspase-1 和IL-1β 的表达量和对照组无明显差异，LPS+鞭毛蛋白组NLRC4 炎症小体活化后上清液中成熟的caspase-1 和IL-1β 明显升高，加入刺槐素干预后，可显著抑制caspase-1 和IL-1β 的表达，并减少炎性因子IL-1β 和IL-18 的释放，但对pro-caspase-1 和pro-IL-1β 的表达影响不显著，表明刺槐素可抑制IL-1β 的分泌，对产生无影响。因此，笔者推断刺槐素可抑制鞭毛蛋白诱导的小鼠骨髓巨噬细胞NLRC4 炎症小体的活化，减少炎症反应。

LDH 通常存在于细胞质中，当细胞质膜受损或者死亡时可释放到细胞外。因此，笔者通过检测LDH 的浓度来反映细胞的损伤情况，本次研究结果显示用鞭毛蛋白刺激巨噬细胞后LDH 的浓度明显上升，经刺槐素治疗后LDH 的浓度显著下降，说明刺槐素可减少细胞的损伤。

综上所述，刺槐素可抑制鞭毛蛋白诱导的NLRC4 炎症小体的激活，降低细胞炎性反应，减少细胞损伤，为后续进一步对刺槐素的研究和临床应用提供理论基础。但刺槐素抑制NLRC4 炎症小体活化的具体机制尚不明确，今后将进一步研究其具体作用机制，这也是下一步的重点研究内容。

作者贡献度说明：

王兆霞：负责参与实验、查阅文献及论文撰写；补娟：负责课题设计指导及实验指导；张晓玲：负责试剂和相关耗材购买，并参与实验；叶勒丹·马汉：负责数据分析；吴选霞：负责参与实验；周玲：负责课题设计、文章写作指导。