重组金黄色葡萄球菌肠毒素B的原核表达、纯化及其免疫原性

韩慧，史伯昌，李欣昱，李华斌，田崇瑜，闫芳，石艳春，郑源强，赵忠鹏

1.内蒙古医科大学内蒙古自治区分子生物学重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010058；2.安徽医科大学基础医学院，安徽 合肥 230032；3.山西农业大学动物医学学院，山西 晋中 030800

葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）由革兰阴性金黄色葡萄球菌分泌，目前金黄色葡萄球菌可产生的肠毒素和超抗原有20种［1］。SEB可激活大量T细胞，但其确切致病机制尚不清楚。正常抗原诱导的免疫反应中0.001%～0.000 1%的人体T细胞被激活，而SEB能激活高达20%的人体T细胞，因为SEB的独特功能可将抗原递呈细胞的MHCⅡ与CD4+、CD8+T细胞的TCR连接［2］。这种连接效应使大量细胞因子和趋化因子释放，尤其是IL-2、TNF-α、CXCL1等，并调节正常T细胞分泌趋化性细胞因子（regulated upon activation normal T cell expressed and secreted，RANTES）［3-4］。过量的细胞因子和趋化因子可导致免疫反应失调并诱发自身免疫疾病［5-6］。恒河猴摄入SEB后可引起呕吐和腹泻，全身性或通过气溶胶吸入会导致致命性休克，而人类暴露于SEB气溶胶后也可能会发生致命性休克，因此SEB具有作为潜在生物武器的特征［7］。

人类需要安全有效的疫苗来预防SEB的超抗原作用。既往的研究主要关注福尔马林灭活后的类毒素疫苗，但尚未批准用于人类。以重组SEB或突变SEB获得的蛋白作为疫苗有望能够预防葡萄球菌肠毒素导致的疾病［8］。作为SEB中毒急救治疗，马抗SEB免疫球蛋白F（ab′）2制品可对症治疗。本研究对SEB基因定点突变体进行克隆表达、纯化，制备了重组SEB蛋白抗原，通过检测其免疫活性、致病力、免疫小鼠产生的抗体效价及中和抗体活性，以证明重组SEB的免疫原性，为研制马抗SEB免疫球蛋白F（ab′）2制品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株及质粒E.coli BL21（DE3）（BTN12-25y）购自北京百奥莱博科技有限公司；PUC57-SEB和pET-22b由军事医学研究院微生物流行病研究所保存。

1.2 实验动物SPF级BALB／c小鼠，雌性，6～8周龄，体重18～20 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物合格证号：SCXK（京）2019-0010。本实验均以科研为目的进行小鼠的养殖及使用，且按照军事医学研究院微生物流行病研究所实验动物管理与使用委员会相关规定进行（IACUC-DWZX-2020-030）。

1.3 主要试剂及仪器NdeⅠ和HindⅢ限制性内切酶、DNA Ligation Kit购自北京六合通经贸有限公司；Plasmid Extraction Mini Kit-普通质粒提取试剂盒（8084011）购自北京达科为生物技术有限公司；SDSPAGE凝胶制备试剂盒、ECL Plus超敏发光液、蛋白marker、羊抗兔IgG-HRP（SolarbioSE134）购自北京索莱宝科技有限公司；Trans 2K DNA marker购自北京全式金生物技术有限公司；兔抗SEB蛋白抗体、天然SEB提取纯化物为军事医学研究院微生物流行病研究所自制；Sephadex G-50 Medium、Q-sepharose 4FF、SP Sepharose 4FF购自美国GE公司。

1.4 重组SEB蛋白抗原基因序列的设计及合成 根据GenBank登录的SEB序列（AB479118.1），并参照文献［9］及SEB空间三维结构模型的预测，分别对46、90和95位SEB疏水结合区、极性结合区和二硫化物区3个位点进行点突变，同时为提高可溶性SEB蛋白的表达量，在此基础上将稀有密码子优化为E.coli偏好密码子，进行序列设计及分析，由苏州金唯智生物科技有限公司合成SEB序列。

1.5 重组SEB蛋白表达质粒的构建 将质粒PUC57-SEB与pET-22b分别经NdeⅠ和HindⅢ双酶切后，胶回收目的基因片段及载体片段，16℃连接过夜；连接产物转化E.coli BL21（DE3），提取质粒，进行双酶切鉴定，并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序正确的质粒命名pET-22b-SEB。

1.6 重组SEB蛋白的表达及纯化 将构建的重组SEB宿主菌株在1 mmol／L IPTG、37℃条件下，诱导8 h；收集菌液，超声破碎后，将细菌裂解上清经SP Sepharose 4FF离子交换凝胶层析纯化，0.1 mmol／L NaCl洗脱，洗脱样品经Sephadex G-50Medium凝胶介质脱盐，再经Q Sepharose 4FF离子交换层析后，采用HPLC法检测重组SEB蛋白抗原纯度。

1.7 重组SEB蛋白的免疫原性

1.7.1 重组SEB蛋白抗原免疫活性检测 采用Western blot法。以兔抗SEB蛋白为一抗（1∶5 000稀释），25℃孵育1 h；以羊抗兔IgG-HRP为二抗（1∶5 000稀释），25℃孵育1 h。以天然SEB为对照。

1.7.2 重组SEB蛋白抗原致病力检测 将BALB／c小鼠分为7组，每组5只。用25、50、100、150、200 μg／200 μL重组SEB蛋白腹腔注射小鼠，并用5 μg／200 μL（10 LD5）0天然SEB及10 mmol／L PBS缓冲液200 μL作为对照。4 h后腹腔注射LPS，50 μg／只。

1.7.3 重组SEB蛋白抗原免疫小鼠抗体效价检测将BALB／c小鼠分为5组，每组5只。用2.5、5、10、20 μg／200 μL重组SEB蛋白腹腔注射小鼠，并用10 mmol／L PBS缓冲液200 μL作为对照。0、14 d免疫2次，第2次免疫后1周，经小鼠尾静脉采血，分离血清，ELISA法检测抗体效价［1］。

1.7.4 重组SEB蛋白抗原免疫小鼠中和抗体活性检测 将BALB／c小鼠分为5组，每组5只。用2.5、5、10、20 μg／200 μL重组SEB蛋白腹腔注射小鼠，并用等量10 mmol／L PBS缓冲液作为对照。0、14 d免疫2次，至21 d，分别再经腹腔注射5 μg／200 μL（10 LD50）天然SEB攻毒；4 h后腹腔注射LPS，50 μg／只；连续7 d观察小鼠死亡情况。

1.8 统计学分析 应用DNAMAN对碱基及氨基酸序列进行分析，Graphpad 6.0进行数据分析。数据间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组SEB蛋白抗原基因序列确定 通过软件处理得出SEB原氨基酸序列（图1A）、定点突变后氨基酸序列（图1B）以及将稀有密码子优化为E.coli偏爱密码子的DNA序列（图1C），为了提高可溶性SEB蛋白的表达量，原稀有密码子AGA改为E.coli偏爱性较高的CGC，两者均编码氨基酸R（Arg）；原GCT改为E.coli偏爱性较高的GCC，两者均编码氨基酸A（Ala）；终止密码子改为E.coli偏爱性较高的TAA。

图1 SEB原氨基酸序列（A）、SEB定点突变氨基酸序列（B）和SEB定点突变并优化密码子后DNA序列（C）Fig.1 Original amino acid sequence（A），site-specific mutated amino acid sequence（B）and DNA sequence with sitespecific mutagenesis and codon optimization of SEB（C）

2.2 重组质粒pET-22b-SEB的鉴定 质粒的双酶切（NdeⅠ／HindⅢ）产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，在723 bp处可见单一条带，大小与预期SEB目的片段一致，见图2。经测序，与合成序列也完全一致。表明质粒pET22b-SEB构建正确。

图2 质粒pET-22b-SEB的双酶切（NdeⅠ／HindⅢ）鉴定Fig.2 Restriction map of plasmid pET-22b-SEB（NdeⅠ／HindⅢ）

2.3 重组SEB蛋白的鉴定 纯化后的细菌裂解上清经12%SDS-PAGE分析，在相对分子质量约28 300处可见含量高的目的蛋白条带，大小与预期相符，见图3。HPLC分析显示，重组SEB蛋白抗原纯度为99%，见图4。

图3 纯化的重组SEB蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE profile of purified recombinant SEB protein

图4 重组SEB蛋白抗原纯度的HPLC分析Fig.4 Analysis of purity of recombinant SEB protein antigen by HPLC

2.4 重组SEB蛋白抗原的免疫活性Western blot分析显示，纯化的重组SEB蛋白相对分子质量约28 300，可与兔抗SEB发生特异性结合，且与纯化的天然SEB具有一致的免疫活性，见图5。

图5 重组SEB蛋白免疫结合活性的Western blot分析Fig.5 Western blotting of immune binding activity of recombinant SEB protein

2.5 重组SEB蛋白抗原的致病力 给予25、50、100、150、200 μg／200 μL重组SEB蛋白以及PBS，小鼠均无死亡，而天然SEB组小鼠全部死亡，表明制备的重组SEB蛋白已获得减毒，且具有有良好的安全性。

2.6 重组SEB蛋白抗原免疫小鼠抗体效价 重组SEB蛋白免疫小鼠具有良好的免疫原性，抗体效价均达到1∶81 920，且5 μg／200 μL剂量组与10和20 μg／200 μL剂量组差异无统计学意义（F=1.467，P=0.2611），见图6。表明制备的重组SEB蛋白抗原具有良好的免疫原性。

图6 ELISA法检测重组SEB蛋白免疫小鼠抗体效价Fig.6 Determination of antibody titers of mice immunized with recombinant SEB protein by ELISA

2.7 重组SEB蛋白抗原免疫小鼠中和抗体活性 各剂量重组SEB蛋白免疫小鼠后，用5 μg／200 μL天然SEB攻毒，小鼠均无死亡，保护率达100%；而PBS免疫的小鼠，攻毒后全部死亡，无保护。表明制备的重组SEB蛋白抗原免疫小鼠后，可有效诱导小鼠产生中和抗体。

3 讨论

金黄色葡萄球菌是全世界范围内流传最广，感染能力最强的细菌之一，随着医疗卫生水平的提高和抗菌药物的发展，金黄色葡萄球菌已得到良好控制，但依然是人类日常生活中最常见的致病菌之一。SEB是金黄色葡萄球菌最重要、最常见的外毒素［10］。研究显示，误食金黄色葡萄球菌超标的食物，大量外毒素可导致严重的胃肠道症状和腹泻［11］，而感染失控甚至细菌和毒素入血，会导致严重的菌血症、败血症、中毒性休克和弥散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）。研究发现，摄入低剂量的SEB足以引起中毒症状，摄入量达4 ng／kg时便会出现明显患病症状，达20 ng／kg时即可致死［12］。因此，开发针对急性重症金黄色葡萄球菌感染的治疗方法和预防性疫苗具有重要意义。至今为止，STEBVax是唯一处于临床试验阶段的在研重组SEB疫苗［13］。

本研究参考STEBVax的突变位点成功对SEB进行了定点突变，经克隆、表达及纯化，获得了高纯度的重组SEB蛋白抗原，对其毒性和免疫原性进行全面检测，结果显示，制备的重组SEB蛋白已获得减毒，并具有良好的免疫原性。据研究，通过抗原免疫马制备的单价和多价马免疫球蛋白F（ab′）2，无论在攻毒时还是在感染病原体之后的对症治疗中，均有明显的保护作用［14-15］，因此，制备马抗SEB免疫球蛋白F（ab′）2在SEB中毒的紧急治疗中是一个有前景的候选方法。本研究为对症治疗的马抗SEB免疫球蛋白F（ab′）2制品的研究及制备奠定了实验基础。