基于网络药理学鉴定人参皂苷Rg3抗卵巢癌的分子靶点研究

崔 熙,张小玲,李 旭,赵 静,赵 乐

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.西安交通大学第一附属医院转化医学中心，陕西 西安 710061；3.西安大兴医院妇产科，陕西 西安 710002；4.西安市人民医院/西安市第四医院生殖医学中心，陕西 西安 710004)

卵巢癌的死亡率居妇科恶性肿瘤之首[1]。卵巢癌的危险因素包括高脂饮食、肥胖、终生未育、子宫内膜异位症、遗传因素等[2-4]。卵巢癌的治疗方法主要为手术辅以化疗及维持治疗[5]。随着医疗技术的不断发展，卵巢癌的治疗方案中也引入了靶向治疗药物，但患者的5年生存率未有显著改善[6-7]。开发新的卵巢癌治疗药物是改善卵巢癌患者预后的一个有效途径。

中草药是中华民族几千年智慧的结晶，越来越多的临床实例证实中草药在保健益寿方面发挥着重要作用，其中人参自古以来就被用作许多疾病的营养强化剂和治疗药物。人参皂苷Rg3是提取自人参的活性单体，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抑制皮肤瘢痕增生和血管生成等特性[8-13]。体内外实验结果表明，人参皂苷Rg3能抑制卵巢癌细胞的体内外增殖、侵袭和转移能力[14-20]。

网络药理学借助于生物信息学、分子生物学主要数据库信息，综合考虑机体内靶标分子、生物效应分子的多种相互作用关系，通过与疾病相关的基因进行联合分析，构建“药物-疾病-靶点”网络，从而促进新靶向药物的研发，提高靶向药物筛选的成功率[21-22]。为探索人参皂苷Rg3抑制卵巢癌的作用机理，本研究采用网络药理学研究方法鉴定人参皂苷Rg3的分子靶点，以便为卵巢癌的临床治疗提供实验依据。

1 研究资料与方法

1.1 研究资料

1.1.1 确定人参皂苷Rg3的作用靶点

借助整合了化学物质、基因、功能表型和疾病之间相互作用的比较毒理基因组学数据库(Comparative Toxicogenomics Database，CTD)(http://ctd.mdibl.org)，检索识别人参皂苷Rg3的潜在靶点。

1.1.2 筛选卵巢癌的靶点分子

对卵巢癌的靶点通过药物靶标数据库(Therapeutic Target Database，TTD)(http://db.idrblab.org/ttd/)和基因卡(GeneCards)网站(https://www.genecards.org/)输入关键词“ovarian cancer”进行筛查，整合信息、去除重复项，得到卵巢癌的靶点。

1.1.3 构建人参皂苷Rg3抗卵巢癌靶点的蛋白互作网络

使用在线韦恩图(Venny 2.1.0)获取1.1.1和1.1.2中检索到的靶点交集，将共有靶点输入STRING蛋白质相互作用数据库(https://string-db.org)，于Organism栏中选择Homo sapiens、限定物种为人源，构建靶点的相互关系网络图，用Cytoscape 3.7.1软件进一步构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络，在输出栏(Exports)中选择下载TSV格式文件，然后将文件中的node1、node2、combined score信息导入Cytoscape 3.7.1软件进行可视化处理，通过Cytoscape内置的“Network Analyzer”对PPI网络进行拓扑学分析，获得各靶点的节点连接度(Degree值)、节点紧密度(Closeness值)和节点介度(Betweenness值)等信息。

1.1.4 人参皂苷Rg3作用于卵巢癌靶点的富集分析和京都基因与基因组百科全书通路分析

首先用R包(3.7.0)将4个共有交集靶点的基因symbol转换为id，然后通过R包(3.7.0)中的Cluster profiler模块对其进行基因本体(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信号通路富集分析。GO富集分析基于超几何分布检验，P<0.05达到显著水平，认为这群基因在该GO术语(term)富集。KEGG信号通路富集分析P<0.05说明其富集显著性强、富集程度高。将所得到的结果使用R包(3.7.0)进行可视化处理。图片中不同的颜色代表不同P值，从蓝色到红色表示P值从大到小，富集程度越来越显著。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养

用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(Gibco-BRL，美国)在二氧化碳培养箱中培养人卵巢癌细胞系3AO、A2780和SKOV3，培养箱条件设定为湿度100%、温度37℃、二氧化碳含量5%。取对数生长期细胞进行药物处理。

1.2.2 药物和抗体

20(S)-Rg3购自天士力制药集团股份有限公司(天津)。将20(S)-Rg3以4mg/mL的浓度溶解于二甲亚砜(DMSO)中作为原液，并在-20℃下保存。使用的抗体有：小鼠抗人β-actin单克隆抗体，兔抗人表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)单克隆抗体(Cell Signaling Technology，美国)；HRP-羊抗兔/鼠二抗(Pierce，美国)。

1.2.3 蛋白免疫印迹实验

将对数生长期的SKOV3细胞以(3×105)个细胞/孔的密度种于6孔板，种板24小时后，一孔加终浓度80μg/mL的20(S)-Rg3作为处理组，另一孔加等浓度DMSO作为阴性对照，处理72小时后用含蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀法缓冲液(radio-immunoprecipitation assay buffer，RIPA)提取细胞总蛋白，二辛可宁酸含量测定法(bicinchoninic acid assay，BCA)定量，加入蛋白体积1/4的5×上样缓冲液，混匀后煮沸变性，按照每孔30μg蛋白进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，0.32A转印90分钟至硝酸纤维素(NC)膜，10%脱脂奶室温封闭3小时，抗人EGFR或β-actin抗体4℃过夜孵育，二抗室温孵育2小时，化学发光成像系统显影拍照。

2 结果

2.1 人参皂苷Rg3对卵巢癌作用靶点的筛选

利用CTD数据库获得人参皂苷Rg3的潜在作用靶点65个；以“ovarian cancer”为关键词，在GeneCards数据库和TTD数据库中搜寻相应靶点，共得到8 412个卵巢癌潜在疾病作用靶点；将人参皂苷Rg3的所有靶点与卵巢癌的所有靶点进行比对，通过Venny 2.1.0软件共获取4个交集靶点，包括EGFR、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1[poly(ADP-ribose) polymerase 1，PARP1]、含杆状病毒IAP重复序列蛋白5(Baculoviral IAP repeat containing 5，BIRC5)和凸素1(prominin 1，PROM1)，见图1。

2.2 人参皂苷Rg3和卵巢癌靶点的互作网络

人参皂苷Rg3与卵巢癌的共同靶点被认为可能是人参皂苷Rg3治疗卵巢癌的作用靶点。将其交集分析获得的4个人参皂苷Rg3抗卵巢癌靶点导入基因/蛋白相互作用检索搜查工具(search tool for the retrieval of interacting genes/proteins，STRING)在线数据库，分析获得PPI网络图，见图2。

借助Cytoscape 3.7.1软件获得PPI网络的拓扑学分析结果，展示了所有靶点的节点连接度(Degree值)、节点紧密度(Closeness值)和节点介度(Betweenness值)，EGFR的节点最大，见图3。节点越大、颜色越深，则度值越大，因此将EGFR确定为后续实验验证的靶点。

2.3 人参皂苷Rg3对基因功能及信号通路的影响

为深入了解各交集靶点的生物学功能，对这些靶点进行了GO富集分析与KEGG信号通路富集分析。GO富集分析得到P<0.05的条目共计433个，包括生物过程(biological process，BP)条目357个、细胞组成(cell composition，CC)条目33个、分子功能(molecular function，MF)条目43个，各类别排名前10位的条目见图4。这些靶点所涉及的生物过程主要为解剖结构稳态(anatomical structure homeostasis)、DNA修复的正向调控(positive regulation of DNA repair)及对DNA损伤刺激反应的正调控(positive regulation of response to DNA damage stimulus)。这些靶点的细胞组成主要分布于染色体区域(chromosomal region)、顶端质膜(apical plasma membrane)、细胞顶端部分(apical part of cell)、核膜(nuclear envelope)等。这些靶点所涉及的分子功能主要有钙粘蛋白的结合(cadherin binding)、蛋白ADP-核糖酶活性(protein ADP-ribosylase activity)及半胱氨酸型内肽酶抑制剂参与的细胞凋亡过程(cysteine-type endopeptidase inhibitor activity involved in apoptotic process)等。

KEGG信号通路富集分析得到P<0.05的通路共计23条，均与肿瘤发生发展密切相关，见图5。富集的主要通路包括结直肠癌(colorectal cancer)、细胞凋亡(apoptosis)、膀胱癌(bladder cancer)、子宫内膜癌(endometrial cancer)等。

2.4 20(S)-Rg3下调卵巢癌细胞的EGFR表达情况

为验证上述分析结果，采用人参皂苷Rg3的主要成分20(S)-Rg3处理了卵巢癌细胞3AO、A2780和SKOV3，采用蛋白免疫印迹法检测20(S)-Rg3对EGFR表达的影响，结果显示，经20(S)-Rg3处理后，3株细胞的EGFR蛋白表达水平显著下调，见图6。

3 讨论

3.1 人参皂苷Rg3介导下卵巢癌细胞中EGFR的表达意义

关键信号转导通路的异常是促进肿瘤进展的重要因素。EGFR的突变、扩增是推动肿瘤进展的重要因素，癌细胞中EGFR信号通路的激活参与了细胞增殖、血管生成、侵袭转移等功能。EGFR过表达或激活与肿瘤患者预后不良相关[23]。有70%以上的卵巢癌患者EGFR通路被激活。EGFR突变或扩增也与化疗耐药密切相关。因此，EGFR被认为是晚期卵巢癌治疗的关键分子靶点。目前发现EGFR下游的信号通路主要包括大鼠肉瘤癌基因/丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶激酶/丝裂原活化蛋白激酶(Ras/Raf/MEK/ERK)和大鼠肉瘤癌基因/磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(Ras/PI3K/AKT/mTOR)通路，以EGFR、Raf和AKT为靶点的药物已获准用于临床，但多项研究报道，在单用或者联合使用的情况下，它们对卵巢癌的治疗有效率均较低[24]。

EGFR是本次人参皂苷Rg3网络药理学研究中富集度最高的靶基因，实验初步证实了人参皂苷Rg3的主要组分20(S)-Rg3处理卵巢癌细胞的EGFR表达显著降低，这为人参皂苷Rg3作用机制的研究提供了实验依据。

3.2 20(S)-Rg3对卵巢癌临床治疗的潜在应用价值

课题组在前期的研究中发现，人参皂苷Rg3的主要组分20(S)-Rg3通过多种途径抑制了卵巢癌的细胞恶性表型。有研究揭示了20(S)-Rg3在卵巢癌细胞和裸鼠皮下荷瘤模型中均能促使缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF-1α)降解，阻断缺氧驱动的癌细胞上皮-间质转化，有效地抑制了卵巢癌的迁移和腹腔内扩散[14]。有研究从DNA甲基化调控机制入手，发现20(S)-Rg3通过降低DNA甲基转移酶DNMT3A的表达水平而抑制其介导的抑癌基因VHL的启动子甲基化，使得卵巢癌细胞中的VHL上调[25]。20(S)-Rg3还可以通过下调DNMT3A介导的microRNA启动子甲基化而促进对有氧糖酵解关键酶HK2和PKM2的直接抑制，进而拮抗有氧糖酵解，发挥抑制卵巢癌的作用[17-18]。这些研究结果证实了20(S)-Rg3的作用途径较为丰富，但其抗卵巢癌的直接靶点有待鉴定。

在实验证实20(S)-Rg3具有抗卵巢癌活性的基础上，本研究进行了网络药理学分析，以期发现潜在的药物作用直接靶点。通过对药物与疾病共同作用靶点的交集分析，借助PPI、GO和KEGG等分析工具，筛选获得靶标，并进行实验验证，本研究证实20(S)-Rg3能够抑制EGFR。

遗憾的是，由于人参皂苷Rg3的生物利用度较低，水溶性和生物膜通透性较差，胃肠道作用不稳定，体内代谢率高，因此临床应用有限。未来可以通过开发有效的给药系统或给药途径来提高人参皂苷Rg3的生物利用度，使其快速高效地应用于临床治疗，这也为后续研究提出了更多的要求[26]。

综上，本研究利用网络药理学方法，快速构建出人参皂苷Rg3-靶点-卵巢癌的网络模型，有利于预测和分析人参皂苷Rg3对卵巢癌的作用途径和药理机制，为人参皂苷Rg3成为卵巢癌临床治疗候选药物提供了理论依据。