阴道微生态失衡与HR-HPV感染及宫颈病变的关系

智艳芳，刘 慧，张 婷，班振英，张 威，曾宪旭

(郑州大学第三附属医院，河南 郑州 450052)

子宫颈癌是女性癌症死亡的第四大原因，全球每年约有50万宫颈癌新发病例和30万死亡病例[1]。目前，消除宫颈癌已成为国际社会共同关注的热点。在我国，宫颈癌的发病不容忽视，2018年中国宫颈癌新发病例近11万，死亡病例近5万[2]。尽管高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papilloma virus，HR-HPV)持续感染是宫颈癌发生的重要危险因素[3-4]，但截止目前，宫颈癌的发病机制仍不十分明确。近年来研究显示，阴道微生态失衡很可能参与了宫颈病变的发生及发展[5-6]。

阴道微生态是由阴道解剖结构、周期性的内分泌变化、阴道局部免疫系统和阴道内微生物菌群组成，阴道正常微生物菌群是阴道微生态的核心内容[7]。研究表明，微生物群在许多器官中具有促癌作用，如幽门螺杆菌感染可能导致胃炎、胃溃疡、胃黏膜萎缩及最终胃癌的发生[8]；结肠内菌群与宿主的相互作用可能导致结、直肠癌的发生[9-10]。目前，女性生殖道内大量的细菌微生物群落是否具有类似的促癌作用尚不明确。因此，本研究比较并分析了经宫颈薄层液基细胞学检查(thinprep cytologic test，TCT)异常与正常者的阴道微生态变化及HR-HPV感染情况，旨在探讨阴道微生态与HR-HPV感染及宫颈病变发生的关系，以期为宫颈癌的预防及治疗提供有效的参考依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选取2018年7月到2021年3月就诊于郑州大学第三附属医院妇科门诊行TCT、HR-HPV及阴道微生态检测的患者1 200例，年龄为20～55岁，平均年龄(35.28±8.34)岁。患者中TCT结果阳性600例为阳性组，其中未明确意义的非典型鳞状上皮细胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS)组300例、低度鳞状上皮内病变(low grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)组150例、高度鳞状上皮内病变(high grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)组100例、宫颈鳞癌(squamous cell carcinoma，SCC)组50例。TCT结果阴性600例为阴性组。

1.2 纳入和排除标准

纳入标准：①年龄在20～55岁，有性生活史；②月经规律，检查时未绝经；③检查前3天未进行阴道冲洗、用药及性行为；④检查前2周无抗生素和激素用药史；⑤自愿接受宫颈HPV、TCT筛查和阴道微生态检测。

排除标准：①妊娠期或哺乳期妇女；②有宫颈锥切或全子宫切除史；③有其他生殖器官感染性疾病；④合并严重的心、肝、肾、造血系统等疾病及精神病；⑤使用免疫抑制剂，患有各种免疫性疾病或恶性肿瘤等免疫功能低下者。

该研究经郑州大学第三附属医院伦理委员会批准(2017医伦审第88号)。

1.3 标本的采集

阴道分泌物的采集：窥阴器暴露宫颈，将无菌棉棒置于阴道上1/3侧壁轻轻刮取3～5次，所采样本置入塑料软管中尽快检测。

宫颈脱落细胞的采集：窥阴器暴露宫颈，用TCT专用刷取材，将刷头中间部分深入宫颈内口，两侧抵住宫颈外口，顺时针旋转3～5圈，将刷头放入装有细胞保存液的样品管中充分涮洗，拧紧瓶盖，贴好标签送检TCT及HR-HPV。

1.4 临床实验室的检测

1.4.1 TCT的检查

由郑州大学第三附属医院病理科3名经验丰富的细胞病理学医生根据宫颈细胞学The Bethesda System 2014版报告系统进行诊断。细胞学结果具体分类为：ASCUS、LSIL、HSIL和SCC。

1.4.2 HR-HPV的检测

严格按HR-HPV E6/E7(16、18/45)mRNA试剂盒使用说明书进行操作，检测HPV16、HPV18/45型，通过信号扩增法进行定量检测。结果判读标准：根据信号-截点(S/CO)比值进行结果判读，S/CO值>0.5判读为阳性；反之则判读为阴性。

1.4.3 宫颈阴道分泌物的检测

将分泌物湿片镜检，并用阴道炎联合检测试剂盒检测分泌物中的过氧化氢、白细胞酯酶、唾液酸苷酶、脯氨酸氨基肽酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶及pH值，严格按照说明书操作。过氧化氢<2μmol/L为阳性，唾液酸苷酶≥7IU/L为阳性，脯氨酸氨基肽酶≥1.1IU/L为阳性，白细胞酯酶≥9IU/L为阳性，乙酰氨基葡萄糖苷酶≥0.1IU/mL为阳性，pH值检测正常范围为3.8～4.5，乳酸杆菌高倍镜下≥100个为阳性。

细菌性阴道炎(bacterial vaginosis，BV)判断标准采用Amsel法：①患者阴道分泌物质稀薄；②阴道分泌物pH值>4.5；③阴道分泌物中存在线索细胞，将l滴生理盐水加入到阴道分泌物中，使用高倍镜观察，视野中线索细胞超过20%；④将1滴10%的氢氧化钾加入分泌物中，出现腥臭味。以上4项中出现任意3项即诊断为BV。

结果判读：清洁度Ⅰ、Ⅱ度为正常，Ⅲ、Ⅳ度为异常；乳酸杆菌、过氧化氢阳性为正常，阴性为异常；加德纳菌、真菌、BV、滴虫阴性为正常，阳性为异常；杂菌、白细胞酯酶+及以内为正常，2+及以上为异常；阴道pH值3.8～4.5为正常，pH>4.5或<3.8为异常；唾液酸苷酶、脯氨酸氨基肽酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶阴性为正常，阳性为异常。

1.5 统计学方法

应用SPSS 25.0统计学软件分析数据，计数资料采用例数(百分率)[n(%)]表示，用R×C卡方(χ2)检验，用Logistic回归模型统计微生态指标与宫颈病变的比值比(OR)及95%可信区间(CI)，并评估阴道微生态指标及HR-HPV感染在宫颈病变发生中的交互作用，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阳性组与阴性组阴道微生态各项指标与宫颈病变的关系

与阴性组相比，阳性组乳酸杆菌、过氧化氢、白细胞酯酶的异常率及HR-HPV感染率均显著增高，经卡方检验差异均有统计学意义(P<0.05)；以因变量为TCT，自变量为阴道微生态各指标及HR-HPV，通过Logistic回归分析得出：乳酸杆菌异常时宫颈病变发生的风险是其正常时的2.319倍、过氧化氢异常时宫颈病变发生的风险是其正常时的2.201倍、白细胞酯酶异常时宫颈病变发生的风险是其正常时的3.376倍、HR-HPV感染时宫颈病变发生的风险是其非感染时的7.114倍，见表1。

表1 阳性组与阴性组阴道微生态各项指标异常率及HR-HPV感染率的比较[n(%)]Table 1 Comparison of abnormal rates of various vaginal microecological indicators and infection rate of HR-HPV between the positive group and the negative group[n(%)]

因素组别例数(n)异常例数χ2POR(95%CI)白细胞酯酶阳性组600319(53.1)98.7140.0003.376(2.644～4.310)阴性组600151(25.2)唾液酸苷酶阳性组600157(26.2)0.1090.7411.045(0.806～1.353)阴性组600152(25.3)脯氨酸氨基肽酶阳性组600154(25.6)0.3610.5481.084(0.834～1.408)阴性组600145(24.2)乙酰氨基葡萄糖苷酶阳性组600152(25.3)0.4510.5021.094(0.841～1.424)阴性组600142(23.7)HR-HPV阳性组600403(67.2)243.8920.0007.114(5.503～9.197)阴性组600134(22.3)

2.2 不同级别宫颈病变阴道微生态指标异常率及HR-HPV感染率的比较

将阳性组600例宫颈病变患者分为ASCUS组、LSIL组、HSIL组和SCC组；其乳酸杆菌、过氧化氢、白细胞酯酶的异常率及HR-HPV感染率随宫颈病变级别的加重而明显增高，经趋势χ2检验差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

再将阳性组600例宫颈病变患者进一步分为HSIL+组(包括SCC和HSIL)和LSIL-组(包括LSIL和ASCUS)，HSIL+组的乳酸杆菌、过氧化氢、白细胞酯酶的异常率及HR-HPV感染率均显著高于LSIL-组，经比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表2 不同级别宫颈病变中乳酸杆菌、过氧化氢、白细胞酯酶的异常率及HR-HPV感染率的比较[n(%)]Table 2 Comparison of abnormal rates of Lactobacillus,hydrogen peroxide,leukocyte esterase and infection rate of HR-HPV in different grades of cervical lesions[n(%)]

表3 HSIL+组与LSIL-组的乳酸杆菌、过氧化氢、白细胞酯酶的异常率及HR-HPV感染率的比较[n(%)]Table 3 Comparison of abnormal rates of Lactobacillus,hydrogen peroxide,leukocyte esterase and infection rate of HR-HPV in the HSIL+ group and the LSIL- group[n(%)]

2.3 HR-HPV感染与阴道微生态指标在宫颈病变发生中的交互作用

以乳酸杆菌、过氧化氢、白细胞酯酶正常，且HR-HPV阴性者为对照，用Logistic回归模型分析结果显示：HR-HPV感染与乳酸杆菌、过氧化氢、白细胞酯酶的异常均存在交互作用，HR-HPV感染与乳酸杆菌异常同时存在的宫颈病变发生风险大于HR-HPV感染或乳酸杆菌异常单独存在时，HR-HPV感染与过氧化氢异常同时存在的宫颈病变发生风险大于HR-HPV感染或过氧化氢异常单独存在时，HR-HPV感染与白细胞酯酶异常同时存在的宫颈病变发生风险大于HR-HPV感染或白细胞酯酶异常单独存在时，见表4。

表4 乳酸杆菌、过氧化氢、白细胞酯酶的异常与HR-HPV感染在宫颈病变发生中的交互作用Table 4 Interaction of abnormalities of Lactobacillus,hydrogen peroxide and leukocyte esterase with HR-HPV infection in the occurrence of cervical lesions

3 讨论

目前认为在宫颈病变的发生发展过程中还有其他重要因素参与其中，且很有可能在HPV感染中也发挥重要作用，而阴道微生态失衡成为近年来研究的热点之一。相关研究表明，阴道微生态与HPV感染甚至于宫颈病变的演变之间存在着密切的关系[11]。

3.1 乳酸杆菌和过氧化氢与宫颈病变的关系

正常的阴道微生态系统在预防女性生殖道感染中起着重要作用。目前对于阴道微生态系统的评价包括阴道病原微生物形态学检测和微生物代谢产物及酶等功能学检测[12-13]。尽管女性生殖道内微生物种类繁多，但主要以乳酸杆菌为优势菌群。乳酸杆菌可以产生乳酸，使阴道pH值保持在3.8～4.5。此外，阴道乳酸杆菌还可以产生过氧化氢、细菌素、类细菌素等物质，可杀灭及抑制其他病原菌的生长，保持其在阴道菌群中的优势地位，借此维持阴道微生态的平衡。阴道内一旦乳酸杆菌减少，其所产生的抗菌物质也会减少，而加德纳菌及杂菌数量就会随之增加，最终导致阴道微生态失衡；而阴道微生态一旦失衡，外来微生物便可轻易入侵并导致生殖道内的炎症。本研究显示：在宫颈病变患者中，阴道分泌物中乳酸杆菌、过氧化氢的异常率明显高于正常者，且随宫颈病变的加重，二者的异常率呈上升趋势，与宫颈病变发生风险显著关联。Korshunov等[14]研究发现，宫颈上皮内瘤变患者阴道内乳酸杆菌的比例减少，各种炎症致病菌的比例增加。逯彩虹等[15]研究结果表明，宫颈癌发生与阴道黏膜乳酸杆菌减少、阴道菌群失调相关。上述报道与本研究结果一致。可见乳酸杆菌具有很好的抗感染和预防宫颈病变的作用；而乳酸杆菌的减少、微生态的失衡，势必会增加HPV感染的机会及宫颈病变发生的几率。此外，有研究表明，阴道微生态内过氧化氢浓度降低与宫颈上皮内瘤变相关[16]。这与本研究结果一致。由此可见，通过测定阴道微生态中乳酸杆菌的数量、过氧化氢的浓度评估阴道微生态的平衡状态，对HPV感染及宫颈病变的发生具有一定的预测作用；而对阴道微生态失衡进行积极的干预，则可以预防HPV感染及宫颈病变的发生。尽管有研究表明，BV与宫颈上皮内瘤变相关[17]；但本研究结果却显示，BV与宫颈病变的发生无明显关联(P=0.274)。

3.2 白细胞酯酶与宫颈病变的关系

白细胞酯酶是人体白细胞产生的一种特异性酶类，白细胞酯酶增多是白细胞增多且结构遭到破坏的直接证据，反映局部上皮黏膜组织浸润受损与强烈炎症反应。白细胞酯酶只存在于中性粒细胞内，因此白细胞酯酶可以反映白细胞的存在，但白细胞并不能反映白细胞酯酶的存在。阴道微生态检测包括白细胞的测定和白细胞酯酶的测定。本研究显示，白细胞酯酶异常率在宫颈病变患者中显著升高，且随宫颈病变的加重，其异常率呈明显上升趋势，与宫颈病变发生风险有关。这表明白细胞酯酶的异常很可能参与了HPV感染及宫颈病变的发生发展。与此同时，本研究并未发现白细胞阳性率在细胞学阴性组与阳性组间具有显著性差异。有研究表明白细胞酯酶与宫颈癌间质浸润相关[18]；但目前鲜见有关白细胞酯酶与宫颈病变关系的研究，其在宫颈病变发生中的相关作用尚待进一步探讨。

本研究显示，阳性组的HR-HPV感染率显著高于阴性组，且随宫颈病变的加重，感染率显著上升，HR-HPV感染时宫颈病变发生的风险是其非感染时的7.114倍(95%CI：5.503～9.197)。可见，HR-HPV感染是宫颈病变发生中最重要的原因。有研究提示，阴道微生态某些指标的失衡可以促进HR-HPV感染的发生[19]，进而导致宫颈癌的发生。李俐等[20]研究发现，HPV16感染及过氧化氢、唾液酸苷酶阳性对宫颈病变的发生具有交互作用。然而，过氧化氢、唾液酸苷酶阳性与HR-HPV感染对宫颈病变发生发展产生怎样的影响尚未明确。本研究通过Logistic回归模型分析发现，HR-HPV感染与乳酸杆菌、过氧化氢及白细胞酯酶的异常在宫颈病变的发生中均存在显著的交互作用，提示在考虑多种因素的基础上，如果HR-HPV感染与乳酸杆菌、过氧化氢、白细胞酯酶的异常同时存在，则会增加宫颈病变的发生风险。因此，保持阴道微生态平衡不仅可以预防或者减少HR-HPV感染的发生，还可能会加速HPV病毒的清除，阻止宫颈病变的进展，甚至是促进宫颈病变回退正常。可见，在HR-HPV感染与宫颈病变患者的治疗中，积极纠正阴道微生态紊乱显得尤为重要。

总之，阴道微生态中乳酸杆菌、过氧化氢、白细胞酯酶的异常与HR-HPV感染存在交互作用，与宫颈病变发生密切相关。积极纠正阴道微生态失衡可能为HR-HPV感染及宫颈病变的防治提供新的诊疗思路。但本研究的样本量有限，且病例具有一定的地域局限性。后期将进一步扩大样本量，筛选与HR-HPV持续感染及病变进展过程关系密切的因子进行信号通路的研究，为指导HR-HPV持续感染后的处理及预防宫颈鳞状上皮内病变的进展提供更多依据。