中药益精方对精索静脉曲张大鼠精子质量的影响

李维仁 褚云香 贾金铭

1.北京航天总医院泌尿外科（北京 100076）；2.应急总医院消化内科（北京 100028）；3.中国中医科学院广安门医院男科（北京 100053）

精索静脉曲张(varicocele,VC)是引起男性不育的常见原因，成年男性发病率为10%～25%，精液常规异常的病人中，VC 患病率为25%～40%[1-2]。VC 导致不育症的病理机制虽然也有大量的研究，如睾丸温度增高、毒素返流、自由基损害等学说，但迄今为止，仍未能清楚解释VC 降低生育力的确切机制[3]。西医临床中，VC 的治疗以手术为主，但是对有些患者的精液质量改善也不是很理想。而中医临床中发现，中药益精方对不育患者有较好的疗效[4-6]。为弥补西医治疗方案的不足，我们有必要探索一条新的中西医结合的治疗道路，以便更好的服务于广大的VC不育患者。

材料与方法

一、实验动物及分组

动物及分组：SPF 级SD 雄性大鼠30 只(北京大学第一医院动物实验中心提供)，体重(180±20)g。常规饲养，整个实验过程中动物自由摄食饮水，室温控制在20-25℃，相对湿度为40%-60%。适应一周后开始实验。将雄性SD 大鼠随机分为3 组，每组10 只，即对照组(假手术组)、VC模型组和治疗组。

二、药物及试剂

益精方是由当归、红花、菟丝子、五味子、仙灵脾等12 味中草药组成，并由中国中医科学院广安门医院药剂科按含生药量2.6g/mL 的标准煎制成标准浓度的益精方水煎剂。精液分析仪（北京伟力）、TUNEL染色试剂盒（Roche 公司）、MDA试剂盒（沈阳万类生物科技有限公司)、精子核DNA完整性检测试剂盒(精子染色质扩散法)（深圳华康生物医学工程有限公司）。

三、造模及给药方法

精索静脉曲张大鼠动物模型的制备[6]：SD 大鼠适应环境1 周后，随机分组，进行手术。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，开腹分离，并于左肾静脉与下腔静脉之间用4-0 丝线将直径约为0.8mm 的金属杆与左肾静脉一起结扎。抽出金属杆，使左肾静脉复通，造成左肾静脉的部分狭窄。对照组取假手术组大鼠，即显露左肾静脉过程相同，但不结扎。

造模成功后，益精方治疗组给予益精方中药水煎剂按生药1mL/(100 g体重·d)灌胃，给予每天1次，连续8 周，对照组及模型组给予对等量的水灌胃，8 周后取材，进行后续实验研究。

四、标本采集

造模8 周后取材，先称重动物，用颈脱臼法处死大鼠，剪开腹腔，暴露左侧精索静脉，再次用千分尺在髂腰静脉水平测量左侧精索静脉的外径，以直径增加2倍或更多为精索静脉曲张模型造模成功，测量后切取睾丸、附睾。附睾取精液进行精子活力、脂质氧化水平、精子DNA碎片率等相关检测。睾丸组织用Bouin液固定。常规石蜡包埋，切片厚度5μm，进行HE染色。

五、检测项目及方法

通过精液分析及约翰逊评分（Johnson score）评估大鼠睾丸的生精功能。通过睾丸TUNEL染色观察生精细胞凋亡情况。通过ELLISA检测大鼠附睾组织MDA的水平，评估脂质氧化的水平。精子DNA 完整性检测用染色质扩散法（sperm chromatin dispersion，SCD），计算精子DNA 碎片率（DNA fragmentation index，DFI）。

六、统计学方法

采用SPSS22.0统计学软件处理。计量资料以均数±标准差（）表示，计量资料组间比较采用方差分析，计数资料采用卡方检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

益精方治疗组与较模型组比较，精索静脉曲张大鼠睾丸约翰逊评分（Johnson score）(9.2±0.51 vs 8.1±0.42 P ＜0.05)、精子活率(59.81±5.27 vs 53.32±4.95 P ＜0.05)、附睾MDA 含量(7.53±1.86 vs 10.40±2.58 mmol/g P ＜0.05)、精子 DNA 碎 片 率 (13.30±2.39 vs 18.36±3.29 % P ＜0.01）、睾丸生精细胞凋亡率(2.87±1.21 vs 5.2±1.74%P ＜ 0.05)差异显著。

表1 益精方治疗组对约翰逊评分、精子活率、MDA水平、DFI水平、生精细胞凋亡的影响

图1 大鼠睾丸HE染色

图2 大鼠睾丸TUNEL染色

讨 论

VC 是男性不育症的常见病因之一。目前西医治疗多采用精索静脉高位结扎术，手术只能解决精索静脉血液返流的问题，而对部分患者不能从根本上改善睾丸生精功能的问题。目前西医方法尚无特效药物，但是中医药在此方面独具优势。

祖国传统医学中，VC不育属筋瘤、筋疝、无子等范畴，其病因病机复杂，概括起来不外虚实二端，以肾虚为本，血瘀为标，肾虚导致血瘀，血瘀加重肾虚，互为因果，相互影响，造成生殖之精化生障碍，从而导致不育。益精方由当归、红花、丹参、仙灵脾、菟丝子等组成。仙灵脾、菟丝子补肾以生精，当归、红花、丹参等活血化瘀，标本兼顾，使肾气得以充，瘀血得以去，生精功能得以恢复，达到治疗不育的目的[4-6,8-9]。

研究表明，活性氧(ROS) 增多及抗氧化能力的下降导致氧化应激损伤精子DNA[10]。其机制可能与疾病、环境和生活方式等因素所导致的生精细胞的凋亡、过多氧自由基的产生及染色质包装过程异常有关[11-13]。DNA 受损的精子即使有能力受精，后期胚胎发育也有可能出现异常。不育和后代基因异常也和父系精子DNA损伤有关[14-15]。我们课题组前期的研究发现，益精方可以减少氧化应激损伤，抵抗氧化应激，可介导PI3K/Akt/mTOR信号通路调控自噬抑制Leydig 细胞凋亡，从而改善少弱精子症的精子质量[6,16]。另有研究发现，精索静脉曲张伴精子DFI 升高的患者术后联合维生素E或辅酶Q10 等抗氧化治疗可以进一步降低精子DFI，提升精子质量[17]。我们也发现，与模型组比较，治疗组大鼠睾丸MDA含量显著降低，这也证实了益精方可以减少睾丸的氧化损伤。进而发现益精方治疗组大鼠睾丸的生精细胞凋亡减少，DNA碎片率减少。因此，我们推测，益精方的抗氧化、抗凋亡效应可能起到保护VC 大鼠的睾丸的作用。

综上，中药益精方能提高精索静脉曲张大鼠的精子质量，其抗氧化效应可能在精索静脉曲张大鼠的睾丸保护中扮演重要的角色。