基于网络药理学克淋通胶囊治疗尿路感染的分子作用机制分析*

邓楹君 刘胜京 高庆和 任 凯 郭 军

中国中医科学院西苑医院（北京 100091）

尿路感染（urinary tract infection,UTI）是肾、输尿管、膀胱和尿道等泌尿系统各个部位感染的总称，是最常见的感染性疾病之一，目前已是仅次于呼吸道感染的第二大感染性疾病。大多数尿路感染由来源于肠道菌群的兼性厌氧菌感染引起，还可由表皮葡萄球菌和白念珠菌等感染引起，常见的致病菌有大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、肠球菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌等，西医治疗以抗生素治疗为主，但易出现耐药性[1]，细菌耐药性产生的机制复杂，一旦产生增加治疗难度，是治疗过程中面临的严峻挑战之一。中医药治疗尿路感染能有效减轻症状，并在降低尿路感染复发率方面具有明显的优势[2]。克淋通胶囊是经典苗方，由头花蓼和黄柏组成，广泛应用于西医尿路感染、慢性前列腺炎、泌尿系统结石等疾病，前期临床观察显示出克淋通胶囊对湿热瘀阻证型的轻中度尿路感染、上尿路结石术后的尿路感染均体现出了良好临床疗效[3,4]，但其作用机制还需要进一步探索。本研究利用网络药理学的方法，研究克淋通胶囊药物成分与靶点的相互作用关系和潜在通路，从而预测其治疗尿路感染的相关机制，为后续克淋通胶囊的进一步研究和尿路感染的治疗提供参考。

材料与方法

一、克淋通胶囊药物活性成分获取

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索克淋通胶囊化学成分。其中，TCMSP 检索条件为药物口服生物利用度（OB）≥30%，药物相似性（DL）≥0.18。在PubChem 数据库中将收集到的化学成分进行确证，并将其化学成分标准化，下载SMILES序列。

二、药物活性成分作用靶点及疾病靶点的获取

通过Swiss 数据库进行作用靶点筛选,筛选规则为probability≥0.9 的靶点。 以“urinary tract infection”为关键词，在GeneCards、OMIM数据库搜索疾病的靶点，获得与尿路感染相关的疾病靶点。

三、潜在作用靶点的获取

利用R 软件，将上述得到的药物靶点与疾病相关靶点相映射，得到克淋通胶囊治疗尿路感染的潜在作用靶点。

四、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

将靶点导入STRING 平台，设置蛋白种类为“Homosapiens”，combinedscore为0.9，构建克淋通胶囊治疗尿路感染的PPI（protein interaction）网络。利用Cytoscape软件绘制PPI网络图，并利用其cytoHubba插件计算图中每个节点的degree 值，以筛选克淋通胶囊治疗尿路感染的核心靶点。

五、富集分析

将克淋通胶囊治疗尿路感染的靶点利用R软件进行基因本体（GO）功能富集分析和京都基因、基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。背景数据库和基因集限定物种为“Homo sapiens”，阈值设置为P＜0.05，即得到功能富集分析中分子功能、生物过程、细胞组分以及信号通路富集分析结果。

六、可视化网络图构建

根据上述得到的成分靶点通路，利用Cytoscape构建克淋通胶囊治疗尿路感染的可视化网络图。

结 果

一、克淋通胶囊药物活性成分的筛选

基于数据库，以OB≥30%且DL≥0.18为标准对克淋通胶囊药物成分进行筛选最终纳入65个有效成分。

二、药物活性成分作用靶点及疾病靶点的获取

通过Swisstarget 数据库获得药物的相关靶点，经筛选后得到481个与尿路感染相关度较高的靶点。

三、药物靶点与疾病靶点相映射

利用R 软件，将上述得到的药物作用靶点与疾病靶点相映射，得到220个克淋通胶囊治疗尿路感染的潜在作用靶点。

图1 尿路感染靶点-克淋通胶囊活性成分韦恩图

四、靶点间相互作用分析

蛋白-蛋白互作网络（PPI 网络）分析显示：与尿路感染相关度较高的有AKT1（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase1）、MAPK1（mitogen-activated protein kinase1）、TP53(cellular tumor antigen p53)、TNF（tu-mor necrosis factor）等，是整个网络的节点蛋白。选取最低相互作用阈值大于0.9的数据，经Cytoscape处理，绘制PPT 蛋白互作网络图(如图2A)，并利用R 软件将出现频次前20 的靶点绘制条形图(如图2B)。

图2 核心靶点PPI蛋白互作分析

五、基因本体功能富集分析

（一）核心靶点GO富集分析

靶点GO分析得到具有显著意义的2753个生物过程，其中分子功能155 个，生物过程2511 个，细胞组分87 个。列出排名前20 的富集结果如图3 所示，主要有对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、对细菌源性分子的反应（response to molecule of bacterial origin）、对氧化应激的反应（response to oxidative stress）等过程。

图3 核心靶点GO富集分析结果图

（二）核心靶点KEGG富集分析

靶点KEGG 富集分析共得到172 条具有显著意义的通路，选取前20条与尿路感染相关度较高的通路（如图4），主要涉及PI3K-Akt信号通路等。

图4 KEGG富集分析图

（三）“药物-活性成分-作用靶点”可视化网络图构建

将通路活性成分及靶点导入Cytoscape软件，计算Degree值并绘制“药物-成分-靶点”的可视化网络图，见图5。

图5 药物-成分-靶点可视化网络图

讨 论

苗药头花蓼是贵州省特产民族药和重点培育发展品种之一，味苦辛，性温，可解毒、散瘀、利尿通淋，配以黄柏清热燥湿解毒，两药合用清利下焦湿热，用于湿热下注、热结膀胱所致的热淋[5]。中医理论认为热淋的产生主要由湿热致病，《诸病源候论·淋病诸候》中云：“诸淋者，由肾虚而膀胱热也。”故用药多以清热利湿通淋为法，克淋通胶囊中药物虽少，但头花蓼味苦辛、性温，苦能清热解毒，辛能行血散瘀，有利尿通淋之效，黄柏苦寒燥湿，擅清利下焦湿热，两药相合，清而不寒，利湿而不伤阴，共奏通淋之功。现代药理学的研究发现，头花蓼和黄柏的主要成分对泌尿系感染常见致病菌具有良好的抑菌效果和抗炎活性，对多重耐药性细菌也有良好的作用[6-8],同时，头花蓼利尿通淋的作用能增加单位时间内肾单位的泌尿量，通过尿液的冲刷作用，减少细菌的附着和减轻炎症反应[9]。

网络药理学基于“药物-成分-靶点-疾病”的相互作用网络，通过可视化网络系统观察药物对疾病的干预方式，符合中药复方治疗疾病的“多成分-多靶点-多通路”的作用机制。本研究采用网络药理学的研究方法，经筛选后得到克淋通胶囊有效成分65 个，垂钓靶点481个，疾病靶点2170个，映射后得到作用于尿路感染的潜在靶点220 个。体现了克淋通胶囊治疗尿路感染具有多成分、多靶点的特点。克淋通胶囊中含有的主要成分有山奈酚、槲皮素、槲皮苷、小檗碱等，山奈酚、槲皮素、槲皮苷均属于黄酮类化合物，广泛存在于多种中草药植物中，现代药理学研究显示黄酮类化合物具有广泛的抗细菌和抗病毒感染的生物活性[10]。山奈酚具有抗炎、抗氧化、抗癌等多种生物活性[11]，槲皮素具有较强的体内外抗菌作用，可抑制多种炎症因子的表达[12]。槲皮苷具有抗氧化能力，并对致炎因子IL-6、TNF-α和NO具有抑制作用，从而发挥抗炎效果[13]。小檗碱是生物碱类化合物，对多种细菌表达出不同程度的抗菌活性[14]。与在尿路感染的发病中，这些黄酮类化合物共同发挥抗菌作用，抑制病原菌的入侵和粘附、抑制机体炎症因子的表达，从而起到治疗尿路感染，减轻下尿路症状的作用。

PPI 分析显示克淋通胶囊治疗尿路感染相关度较高的靶点有AKT1、MAPK1、TP53、TNF等，这些靶点常常出现在全身多种炎症反应之中，在细胞凋亡、介导炎症因子的表达和调节免疫等方面发挥着重要作用[15,16]。GO 分析结果显示克淋通胶囊可能在膜筏、膜微区、质膜筏、细胞基部等位置发挥结合泛素样蛋白连接酶和受体配体活性等分子功能，通过调节机体对脂多糖的反应、对细菌源性分子的反应、对氧化应激的反应等生物过程起作用。KEGG富集分析显示主要涉及PI3K-Akt信号通路，AKT1 是PI3K/AKT 通路上的主要因子[17]，AKT1 缺乏增加炎症中介导中性粒细胞募集的趋化因子的表达，感染期间中性粒细胞中AKT1 表达下调，并与急性炎症中中性粒细胞的炎症活动呈负相关[18]。既往实验研究也印证了克淋通组方的抗炎效果[19]。

综上所述，本研究应用网络药理学研究方法，对克淋通胶囊化学成分与尿路感染相关靶点进行网络分析，克淋通胶囊可能是通过抑制细菌活性和炎症因子的表达、恢复尿路黏膜的屏障作用、抑制病原菌的粘附与侵袭等发挥多成分多靶点作用治疗尿路感染。克淋通胶囊可用于轻中度的泌尿系感染，并在与抗生素联用治疗复杂性泌尿系感染方面具有一定的临床应用价值。