亮腹釉小蜂产品的质量标准

陈玲玲，黄承志，毛润乾，修宝林，高 晶，叶凤娴，Mubasher Hussain，邱栋梁，申宝营，王朝红*

（1. 福建农林大学园艺学院，福州 350002；2. 广东省科学院动物研究所/广东省动物保护与资源利用重点实验室/广东省野生动物保护与利用公共实验室/广东省矿物油农药工程技术研究中心，广州 510260）

柑橘木虱Diaphorina citriKuwayama是柑橘类植物的重要害虫之一，也是柑橘毁灭性病害——柑橘黄龙病最主要的传播媒介，因此防控柑橘木虱是柑橘产业的关键举措。亮腹釉小蜂Tamarixia radiate(Waterston)是柑橘木虱的优势寄生蜂，常寄生柑橘木虱 4～5龄的若虫[1,2]。一头亮腹釉小蜂通过取食和寄生的方式可杀灭柑橘木虱若虫多达500头。研究表明[3]，柑橘园释放亮腹釉小蜂可有效控制柑橘木虱，在美国得克萨斯州，大量释放亮腹釉小蜂可使柑橘木虱种群数量降低 91.2%[4]。目前，亮腹釉小蜂已被世界各地的柑橘种植区引入用于防控柑橘木虱[5-7]，并在巴西[8]、墨西哥[9]、美国加利福尼亚州[10]、得克萨斯州[4]和佛罗里达州等地[11]实现工厂化生产。在中国，广东省科学院动物研究所于2020年实现规模化生产[12]。

然而，不同地区生产的亮腹釉小蜂对柑橘木虱的寄生效率有明显差异。在美国佛罗里达州，亮腹釉小蜂在春夏季寄生率相对较低，平均寄生率＜20%，而在秋季平均寄生率可达 60%以上[5]；在巴西，寄生率为 43.3%～88.8%[8]；在墨西哥西部，平均寄生率达 60.58%[14]。这可能受释放地温度、湿度等环境因素影响，也与亮腹釉小蜂的质量相关。尤其是同一释放地区寄生率的大幅度波动，极可能与寄生蜂质量有直接关系。因此，建立亮腹釉小蜂质量评价标准，对其生产和应用有重要意义。

建立亮腹釉小蜂质量评价标准，首先要保证产品的纯度，在形态特征和分子数据方面确认物种。研究表明，亮腹釉小蜂的寄生能力与其活动能力、发育状态、个体大小及性别比例等因素息息相关[8]。体色光鲜、健全的亮腹釉小蜂才能有效寄生柑橘木虱，残肢或残翅的雌蜂存活困难，无法进行寄生活动。亮腹釉小蜂营两性生殖，仅雌性可以寄生，雄性本身并无寄生能力。因此，维持较高水平的雌性比例（雌蜂率），才能保证亮腹釉小蜂对柑橘木虱的防控效果。亮腹釉小蜂在20 ℃左右贮存3 d，仍能保持较高的存活率和寄生能力，但在高温条件下其死亡率大大升高[8]。生产上获得亮腹釉小蜂产品后，需尽快将其转移至气候箱保存，并尽快运送至田间释放。但在实际生产中往往需要一定时间，检测天敌产品短时间内不同温度下的存活能力可反映产品质量。寄生能力是亮腹釉小蜂产品质量好坏最直接的表现。前人研究表明，亮腹釉小蜂在不同地区对柑橘木虱的寄生能力有明显的差异，在菲律宾，田间的寄生率为 15%～67%[7]；在中国台湾，寄生率为30%～87%[6]；在美国，田间寄生率可高达91.2%[4]；对亮腹釉小蜂产品的寄生能力进行检测极有必要。因此，本文选定亮腹釉小蜂的形态特征、分子特征、外观（体色暗淡率和残肢残翅率）、包装数量、雌蜂率、寄生率及不同贮存温度条件下寄生蜂死亡率（15 ℃、25 ℃及30 ℃）共7个项目作为质量评价指标，以广东省科学院动物研究所生产的亮腹釉小蜂为测试对象进行质量检测，根据检测结果建立和制定亮腹釉小蜂成虫的产品质量标准。

1 材料与方法

1.1 寄主植物与供试虫源

年橘Citrus reticuiataBlanco cv. Nianju购自广州，种植于广州农业技术推广中心温室，室内阳光充足，定期浇水施肥，及时修剪，保证充足的嫩梢嫩枝供试验使用。

柑橘木虱种群采自广东省科学院动物研究所实验室，以年橘为植物载体饲养于网室内作为试验用虫。

亮腹釉小蜂为广东省科学院动物研究所生产产品，成虫，每瓶200头左右（瓶身标识：每瓶含亮腹釉小蜂200头）。

1.2 仪器设备

PCR仪（广州市昊洋贸易有限公司）、DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）、XW-80A旋涡混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、MSHOT体视显微镜MZ62（广州市明美光电技术有限公司）、恒温恒湿培养箱（天津赛得利斯实验分析仪器制造厂）、60目防虫袋、吸虫器（湖北广之应科技有限公司）

1.3 物种形态特征

物种形态特征是物种种类鉴定的基础。对亮腹釉小蜂产品质量进行评价首先应进行形态鉴定，保证物种形态特征与前人描述[8,15]相吻合。本文随机选择5瓶亮腹釉小蜂，每瓶取其中10头（5头雌、5头雄）进行物种形态鉴定。

1.4 物种分子特征

近年来利用基因序列对物种进行鉴定的方法得到广泛的推广和使用。目前在GeneBank上已能查到亮腹釉小蜂的多个基因序列特征，本文根据Folmer等[14]和Barr等[15]的试验方法，分别利用细胞色素氧化酶I（cytochrome oxidase subunit I，COI）的保守区域和内转录间隔区1、2（internal transcribed spacer，ITS-1、ITS-2）进行物种分子鉴定。

随机抽样选择5瓶亮腹釉小蜂，每瓶取其中1头进行总DNA的提取，试剂盒选用天根生物血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（DP304），试验步骤严格遵循试剂盒说明。PCR反应使用50 µL体系，DNA模板2 µL，引物各0.5 µmol/L（表1），25 µL Mix（2X SanTaq PCR Mix 预混液，含蓝染料，生工生物B532061），用无菌水补足。

表1 分子鉴定选用的上下游引物Table 1 Upstream and downstream primers selected for molecular identification

反应条件：预变性94 ℃（5 min）→变性94 ℃（30 s）→退火50～60 ℃（30 s）→延伸72 ℃（30～60 s/kb）→延伸72 ℃（10 min）→保存4 ℃（∞），其中第2步变性至第4步延伸重复35个循环。

1.5 雌蜂体色及残疾检测

利用体式显微镜观察亮腹釉小蜂是否体色暗淡，是否残翅残肢。随机选择 10瓶亮腹釉小蜂，每两瓶为1个样本，从两瓶中取200头雌性亮腹釉小蜂测试，记录体色暗淡或出现残翅残肢的雌蜂数量，并分别统计体色暗淡和残肢残翅个体数量占总数的比率（体色暗淡率和残肢残翅率），共检测5次。

1.6 数量检测

随机选择5瓶亮腹釉小蜂进行手动计数，记录每瓶中亮腹釉小蜂的实际数量，计算每瓶亮腹釉小蜂数量占包装瓶标识数量（200头/瓶）的比率，每瓶为一个样本，共检测5个样本。

1.7 雌蜂率检测

本文随机选择5瓶亮腹釉小蜂，记录其雌蜂数量，统计雌蜂率，重复5次。

1.8 不同温度下亮腹釉小蜂贮存死亡率检测

随机选择15瓶亮腹釉小蜂并分成3组，每瓶取100头；将各组亮腹釉小蜂分别置于温度15 ℃（低温）、25 ℃（常温）、30 ℃（高温），相对湿度50%～70%、光周期14L:10D的人工气候箱中处理10 h；记录亮腹釉小蜂的死亡数量，统计死亡率。

1.9 寄生率检测

准备带有嫩稍的年橘，选取合适位置套15 cm×15 cm的60目防虫袋，在其中转入100头4龄末柑橘木虱若虫。从1瓶亮腹釉小蜂产品中随机选取10头雌虫转入上述防虫袋中，24 h后移除亮腹釉小蜂。7～9 d后检查统计被寄生的柑橘木虱数量，统计寄生率。以上试验在26 ℃，相对湿度60%，光周期14L:10D的条件下进行，重复5次。

2 结果与分析

2.1 物种形态特征

（1）雌蜂

体长0.92～1.04 mm，大部分黑褐色，复眼和单眼红褐色，头宽于长，上颚2齿及1截齿，下颚须和下唇须各1节。触角8节（触角式1，1，3，3），具1小环状节；柄节长为宽的3.7倍；梗节等长或稍长于第1索节；第1～3索节长比分别为11:10:9，分别具4～7个刺状感觉器；棒节3节，末端具针状突出，各棒节分别具7～11个刺状感觉器。触角基节暗褐色，柄节浅色，背缘暗色，其余各节暗黄色。

中胸盾中叶近侧缘具2对毛，小盾片亚中线外缘具2对毛，盘状感觉器靠近前1对毛；并胸腹节褶不完整，具不规则的网状纹。翅透明，前翅长为宽的2.3倍；亚缘脉端部呈折断痕，亚缘脉具1根刚毛，端部下方具2～3根毛；前缘室基部具1～2根细毛，端部具3～4根细毛；缘脉具7～9根刚毛。足跗节4-4-4，足浅黄色，基节和跗节末端暗褐色。

腹部腹板黄色，第1～4节背板或第1～5节背中央大部分黄色，呈大黄色斑。第3产卵瓣暗褐色，产卵器从腹部第2腹节伸出，稍突出腹末端，产卵器为中足胫节长的1.6倍，第3产卵瓣为产卵器长的0.2倍（图1）。

图1 亮腹釉小蜂（Patrícia Milano绘图[8]）Fig. 1 Tamarixia radiata（Patrícia Milano[8]）

（2）雄蜂：

体色与形态相似于雌虫，体长0.84～1.05 mm。触角9节（触角式1，1，4，3）；柄节基向近2/5～1/2处具1小长圆形感觉区；索节4节，各节分别具1排6～7根长刚毛；第1棒节1排刚毛稍短，棒节末端具针状突出。腹部第1～2节背板中央大部分暗黄色，边缘黑褐色，呈小暗黄色斑；腹部第1～3腹板大部分暗黄色，其余腹板黑褐色。雄性外生殖器长，从腹部第4腹节基部伸出，指状突端部暗褐色（图1）。

2.2 物种分子特征

亮腹釉小蜂分子鉴定结果显示，目的基因COI、ITS-1和ITS-2在NCBI（National Center for Biotechnology Information Search Database）数据库中比对的种内相似度均较高（表2）：COI的种内相似度为98.5%～100.0%，而与数据库中同属的其他种间相似度不高于94.0%；ITS-1种内相似度最低为97.9%，而与同属的其他种相似度仅为82.0%；ITS-2种内相似度为99.0%～100.0%，种间相似度小于82.7%。因此本标准规定，COI、ITS-1和ITS-2相似度应高于97%，则认为该种为亮腹釉小蜂。

表2 亮腹釉小蜂分子鉴定信息Table 2 Tamarixia radiata molecular identification information

2.3 雌蜂外观检测结果

检测结果如表3，在5次亮腹釉小蜂雌蜂外观检测中，亮腹釉小蜂体色暗淡率最高为1.5%，亮腹釉小蜂残肢残翅率的比率最高为0.4%。

表3 亮腹釉小蜂检测结果Table 3 Test data of Tamarixia radiata

本文根据检测结果并结合生产实际，规定亮腹釉小蜂产品中的雌性亮腹釉小蜂体色暗淡率不高于2.0%、残肢残翅率不高于1.0%。

2.4 数量检测结果

检测结果如表3所示，随机抽取5瓶亮腹釉小蜂产品，其数量占标识的比率最低为99.0%。根据检测结果结合生产实际，本文规定产品包装中亮腹釉小蜂的数量比率不低于标识数量的95.0%。

2.5 雌蜂率检测结果

本文检测结果如表3所示，在5次检测中，雌蜂率最低为71.0%。所以，本文规定产品质量标准中的雌蜂率不低于70.0%。

2.6 不同温度下亮腹釉小蜂贮存死亡率检测结果

天敌产品的耐贮存能力是决定天敌能否进行规模化生产和作为商品进行运输的决定性条件之一。亮腹釉小蜂在不同贮存条件下的死亡率反应其抗逆能力和对环境的适应能力，是保证亮腹釉小蜂能够有效寄生的指标之一，也是亮腹釉小蜂质量指标一种重要参数。由于缺乏文献和标准参考，本标准根据预试验结果，将亮腹釉小蜂在不同温度条件下贮存10 h后，记录其死亡率。

检测结果如表3，15 ℃低温贮存死亡率最高为3.0%，25 ℃常温贮存死亡率最高为2.0%，30 ℃高温贮存死亡率最高为4.0%。

根据检测结果，规定产品质量标准中不同温度下亮腹釉小蜂贮存死亡率均不得高于5.0%。

2.7 寄生率检测结果

本次检测结果发现，随机抽取的亮腹釉小蜂寄生率最低为92.0%，最高可达到100.0%（表3）。因此，本质量标准规定，亮腹釉小蜂产品在实验室条件下寄生率不低于90%。检测结果用于质量评价指标，不能用于田间标准评价。

3 讨论

迄今为止，国际上巴西等国实现了亮腹釉小蜂的工厂化生产，在国内 2020年广东省科学院动物研究所实现了规模化生产[8-13]，而并无有关亮腹釉小蜂的质量标准的研究。本文首次确定了亮腹釉小蜂成虫质量的检测项目和检测指标，检测项目包括检测物种形态及分子特征、外观（体色暗淡率、残肢残翅率）、产品数量、雌蜂率、寄生率及不同温度下（15 ℃、25 ℃及30 ℃）亮腹釉小蜂贮存死亡率共7个质量指标。通过检测广东省科学院动物研究所生产的亮腹釉小蜂各项指标，首次确立了指标参数，制定了亮腹釉小蜂成虫的质量标准，见表4。

表4 亮腹釉小蜂产品质量标准Table 4 Product quality standards of Tamarixia radiata

在物种分子特征检测上，常用细胞色素氧化酶 I（cytochrome oxidase subunit I，COI）的保守区域、内转录间隔区1、2（internal transcribed spacer，ITS-1、ITS-2），本文做的这两种检测都是可以用于质量技术检测，在生产实际中只需选择其中一种即可；而简单重复间序列（Inter simple sequence repeat，ISSR）电泳条带特征[16]进行物种分子检测时，由于不易操作，所以不作为物种分子特征检测的方法。

在不同温度下贮存寄生蜂死亡率检测上，目前采用15 ℃（低温）、25 ℃（常温）及30 ℃（高温）3种温度，将亮腹釉小蜂分别置于这3种温度下处理10 h后进行检测。对于在变温条件下贮存不同时间寄生蜂死亡率的检测方法，暂无可行的方法，还有待研究。

利用本标准检测评价广东省科学院动物研究所寄生蜂天敌工厂生产出来的亮腹釉小蜂成虫[17]，结果表明该标准检测方法合理，可操作性强。