嘴突凸脐蠕孢菌Y9511油剂剂型研究

董朝霞，刘灵锐，俞雯雯，陈 勇*

（1. 华南农业大学林学与风景园林学院，广州 510642；2. 华南农业大学农学院，广州 510642；3. 广东烟草韶关市有限公司乳源县分公司，韶关512700）

微生物除草剂是把植物病原微生物或其代谢产物当作活体成分，可以渗透杂草内部，从而消灭杂草的一种微生物制剂[1]。它可以专一选择目标杂草，且对环境的压力小，对作物的安全性高，符合绿色生态的要求，越来越受到研究学者们的关注，并且已取得一定成效[2-4]。自然界中的具有除草活性的真菌、细菌和病毒均可作为微生物除草剂的来源，但目前开发最多的是真菌。有研究表明，目前至少40个属、80多种植物病原真菌或将成为微生物除草剂的有效成分[5,6]，但尚无微生物除草剂用于防除千金子。

嘴突凸脐蠕孢菌分离自感病千金子植株，华南农业大学杂草实验室已对嘴突凸脐蠕孢菌Y9511菌株的生物学特性做了探究，明确了其生长所需的最适温度、初始pH、光照条件以及室内培养所需的营养元素；室内条件下，喷施1×106孢子/mL Y9511孢子悬浮液后跟踪观察，第21 d时，对千金子的株防效和鲜重防效均达到100%；通过对水稻及其他8种杂草和作物的安全性研究，其寄主范围相对专一，可以成为活体微生物除草剂中的有效成分[7,8]。但真菌菌株在自然环境中极其不稳定，容易受外界环境影响而失去活性。研究表明，将菌株作为活体成分并与不同助剂混合，发现菌株寿命得到延长、有效活性被提高[9,10]。

油剂是指将细菌或真菌的分生孢子溶在油基里，不加水便能直接喷洒的一种剂型，孢子在油介质中的存活率相对较高，根据剂型性质、用途和靶标等需求，是微生物农药的适用剂型。这种剂型不使用有机溶剂，可避免配方中出现游离水，是能够较长时间保持微生物活性的剂型之一[11,12]。Xu等[13]的研究表明，植物油能够增强药液在狭瓣天竺葵上的铺展面积。且油类助剂可以适当增加微生物制剂的黏度，增加制剂在植物叶片的滞留量，增强制剂抗雨水冲刷能力[14,15]。同时，利用油滴附着在叶片上，润湿性和附着性均优于其他剂型，雾滴和药液量相对较少，对作物具有一定安全性，常用于超低量喷雾，且对环境污染小[11]。李农昌等[16]制备的球孢白僵菌Beauveria bassiana油剂中的孢子贮存期可达6～12个月，在进行超低量喷雾防治时，当即杀虫效果达70%以上，1个月内害虫白僵率可达70%以上，体现出短期控制与长期控制结合于一体的优点。洪士茂和姚钟杰[17]制备的杀灭草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的绿僵菌油剂在4 d左右能达到50%以上死亡率。

1 材料与方法

1.1 供试材料

嘴突凸脐蠕孢菌Y9511分离自感病千金子植株，目前保存在广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC）。

PDA培养基配方：40.1 g马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、5～8 g琼脂，蒸馏水补至1000 mL。

平板菌种：挑取嘴突凸脐蠕孢菌Y9511的分生孢子于PDA培养基，恒温28 ℃培养14 d。

孢子悬浮液：用无菌水按10 mL/皿稀释平板菌种，经四层纱布过滤所得。

载体：珍珠岩、硅藻土、滑石粉、高岭土、白炭黑。

溶剂油：大豆油、玉米油、芝麻油、花生油、稻米油、葵花籽油。

表面活性剂：农乳500#、农乳700#、农乳600#、农乳601#、农乳602#、农乳1601#、BY-120#、吐温-80、吐温-20。

稳定剂：羧甲基纤维素钠（以下简称CMC-Na）、海藻酸钾、海藻酸钠。

1.2 嘴突凸脐蠕孢菌Y9511分生孢子的固态发酵

浸泡24 h后的优质大米加热2 min，121 ℃高温蒸汽灭菌。用无菌水按10 mL/皿稀释平板菌种，得到的孢子悬浮液与大米混合，28 ℃恒温培养14 d。发酵期间每日揉搓大米，使菌均匀分散，减少其他病菌污染。当大米由白色转为灰黑色时，用检验筛（180目）筛得孢子粉，并放入4 ℃的冰箱保存。

1.3 嘴突凸脐蠕孢菌Y9511分生孢子萌发率测定

取1 g 步骤1.2收集到的孢子粉，与10 mL的灭菌水充分混合，取0.1 mL至载玻片上，于玻璃培养皿中垫有湿润滤纸，28 ℃恒温培养4 h。挑取5个视野，统计明显长出芽管的孢子，重复3次，按下列公式检测孢子的活力。分生孢子萌发率（%）＝（萌发的分生孢子数/总分生孢子数）×100。

1.4 载体筛选

1.4.1 载体种类对嘴突凸脐蠕孢菌Y9511菌落直径及产孢量的影响 配制浓度1%（W/V）的不同载体的PDA培养基，121 ℃高温蒸汽灭菌后，倒入直径为9 cm的玻璃培养皿，自然凝固后接种已生长7 d的平板菌种，恒温培养（28 ℃）7 d，用十字交叉法测量菌落直径。培养14 d后，用10 mL无菌水洗下分生孢子，测量产孢量。对照为没有载体的PDA培养基。每个处理3次重复。

1.4.2 载体种类对嘴突凸脐蠕孢菌 Y9511分生孢子萌发的影响 以孢子粉（mg）∶载体（mg）为 2∶1的比例混合均匀，室温下保存两周后，用10 mL的灭菌水稀释，取0.1 mL混合液滴在无菌载玻片上，在培养皿上垫好湿润滤纸，恒温28 ℃培养4 h。统计方法同1.3。每个处理3次重复。

1.4.3 孢子粉与珍珠岩的比例对嘴突凸脐蠕孢菌 Y9511分生孢子萌发的影响 孢子粉与珍珠岩比例分别为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3（以mg为单位）混合均匀，室温下保存两周。其他试验方法同1.3。每个处理3次重复。

1.5 表面活性剂筛选

1.5.1 表面活性剂种类对嘴突凸脐蠕孢菌Y9511菌落直径及产孢量的影响 配制浓度2%（W/V）的不同表面活性剂的PDA培养基，121 ℃高温蒸汽灭菌后，倒入培养皿，其他试验方法同1.4.1。对照为没有表面活性剂的PDA培养基。每个处理3次重复。筛选出三种表现较好的表面活性剂。

1.5.2 表面活性剂分散力的测定 根据杨爽[18]的分散力测定方法，将步骤 1.5.1选出来的三种表面活性剂配制成一定浓度的溶液，与孢子粉混合后，迅速搅拌，在上、中、下三层取样，在显微镜下挑取5个视野观察孢子数。表面活性剂的分散优良程度以分散指数（I）为指标，按下列公式进行计算。当I＜1时，孢子均匀分布；当I＝1时，孢子随机分布；当I＞1时，孢子聚集分布。当I＜1时，I越小，孢子分布越均匀。根据分散指数的大小，确定最佳表面活性剂。I＝σ2/（σ：标准差；：样本平均数）

1.5.3 农乳1601#的浓度对嘴突凸脐蠕孢菌Y9511孢子萌发的影响 分别取农乳1601#0.01 mL、0.03 mL、0.05 mL和0.1 mL，与30 mg孢子粉混合均匀，室温下保存两周后，用10 mL灭菌水混合均匀后，取0.1 mL于培养皿上进行保湿，恒温28 ℃培养4 h，其他试验方法同1.3。每个处理3次重复。

1.5.4 农乳1601#的浓度对分散性能的影响 分别取农乳1601#0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL和1 mL，与100 mL灭菌水分别配制成0.1%、0.3%、0.5%和1%的溶液，加入30 mg孢子粉混合均匀后，立刻在上、中、下三层取样，在血球计数板上观察。统计方法同1.5.2。

1.6 油类助剂的筛选

1.6.1 油类助剂种类对嘴突凸脐蠕孢菌Y9511直径及产孢量的测定 配制浓度5%（W/V）的不同油类助剂的PDA培养基中，121 ℃高温蒸汽灭菌后，倒入培养皿。其他试验方法同1.4.1。对照为没有油类助剂的PDA培养基。每个处理3次重复。

1.6.2 油类助剂种类对嘴突凸脐蠕孢菌Y9511分生孢子萌发的影响 以孢子粉（mg）:油类助剂（mL）为2:1的比例混合均匀，室温下保存两周。其他试验方法同1.3。每个处理3次重复。

1.6.3 孢子粉与大豆油的比例对嘴突凸脐蠕孢菌 Y9511分生孢子萌发的影响 孢子粉与大豆油比例分别为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4（孢子粉单位为mg；大豆油单位为mL）混合均匀，室温下保存两周。其他试验方法同1.3。每个处理3次重复。

1.7 106孢子/mL孢子悬浮液的最大吸光波长确定

1.7.1 嘴突凸脐蠕孢菌Y9511孢子悬浮液配制 将嘴突凸脐蠕孢菌Y9511菌株接种到PDA培养基中，恒温28 ℃培养14 d，用无菌水洗下孢子后，四层纱布滤除菌丝得到孢子悬液，在血球计数板观察，配制孢子悬浮液的浓度为106孢子/mL。

1.7.2 嘴突凸脐蠕孢菌Y9511孢子悬浮液最大吸光波长确定 将步骤1.7.1的孢子悬浮液，在波长范围为340～1000 nm的可见光分光光度计上测量其吸光值。初始波长值350 nm，每隔100 nm测量一次。当吸光度呈现下降趋势后，在350～450 nm的范围内，每隔10 nm再次测量其吸光度。将所有测量波长所对应的吸光度作曲线分析，106孢子/mL孢子悬浮液的最大吸光度就是曲线的峰值，对应波长则为最大吸收波长。

1.8 稳定剂的筛选

1.8.1 稳定剂种类对嘴突凸脐蠕孢菌 Y9511菌落直径及产孢量的影响 配制浓度 0.5%（W/V）的不同稳定剂的PDA培养基，放入121 ℃高温蒸汽灭菌后，倒入直径为9 cm培养皿。其他试验方法同1.4.1。对照为没有稳定剂的PDA培养基。每个处理3次重复。

1.8.2 稳定剂的稳定性测定 配制一定浓度的不同稳定剂溶液，与30 mg孢子粉充分混合，波长值为360 nm，在分光光度计下分别放置0 min、5 min、15 min、30 min、45 min和60 min，测出其吸光度后进行拟合分析，通过斜率大小比较其稳定性。每个处理3次重复。

1.8.3 稳定剂的悬浮率测定 按GB/T 14825-2006 《农药悬浮率测定方法》进行悬浮率测定，筛选出悬浮性最好的稳定剂。配制浓度为0.01%、0.03%、0.05%、0.1%、0.3%、0.5%和1%（总体积为250 mL）的海藻酸钾溶液，称取0.5 g孢子粉，精确至0.0001 g，分别加入装有海藻酸钾溶液的烧杯中，迅速搅拌，在32 ℃水浴中放置30 min后，迅速用移液枪将内容物的9/10（即225 mL）悬浮液移出，不要摇动或挑起量筒内的沉降物，按规定方法测定试样和留在量筒底部25 mL悬浮液中的有效成分质量。试样中有效成分悬浮率W（%）按以下公式计算：W（%）＝（m1—m2）/m1×（10/9）×100，其中，m1：配制悬浮液所取试样中有效成分质量，单位为克（g）；m2：留在量筒底部25 mL悬浮液中有效成分质量，单位为克（g）；10/9：换算系数。

1.8.4 海藻酸钾的浓度对嘴突凸脐蠕孢菌 Y9511分生孢子萌发的影响 海藻酸钾溶液的浓度 0.01%、0.03%、0.05%、0.1%、0.3%、0.5%和1%，与30 mg孢子粉混合均匀，室温两周后取0.1 mL滴在无菌载玻片上，置于培养皿中湿润培养4 h。其他试验方法同1.3。每个处理3次重复。

1.9 数据统计与分析

试验数据采用 SPSS（20.0）数据处理系统和 Excel 2016进行统计分析，试验结果方差分析后进行Duncan’s多重比较检验差异（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 嘴突凸脐蠕孢菌Y9511孢子萌发率的测定

随机选取5个视野，每个视野内明显长出芽管的孢子数/视野内总孢子数分别为32/35、30/31、30/30、34/36和32/32。孢子萌发率为96.34%，说明收集的孢子活力较高，可作为本次试验的材料。

2.2 载体的筛选

载体的种类会对嘴突凸脐蠕孢菌Y9511的菌落生长速度和产孢具有一定影响。由图1的试验结果可知，不同载体与对照相比，菌落直径存在显著性差异。PDA培养基添加了不同载体后，均减缓了菌落的生长速度，其中，添加硅藻土的培养基菌株生长最慢，菌落直径只有7.73 cm。

图1 载体种类对嘴突凸脐蠕孢菌Y9511菌落直径及产孢量的影响Fig. 1 The effect of carrier types on the colony diameter and spore production of E. rostratum Y9511

从产孢量来看，不同载体均能促进菌株Y9511产孢。当以珍珠岩、滑石粉为载体时，对菌株的产孢有明显的促进作用，添加珍珠岩能使菌株Y9511的产孢量达到5.3×106孢子/mL，添加滑石粉能使产孢量达到4.5×106孢子/mL，与对照差异显著（P＜0.05)。

将孢子粉（mg）与载体以2:1（mg）的比例配制后，滑石粉和珍珠岩的添加对孢子萌发有促进作用，萌发率能达到43.3%和50.0%。其余3种载体添加均对孢子萌发有抑制作用，添加高岭土后萌发率为41.3%，添加硅藻土后为36.0%，添加白炭黑后为38.6%。珍珠岩的成本比滑石粉低，从制剂的开发角度看，商品化生产应以尽量低成本的原料来获取效益高的产品，综上所述，珍珠岩作为载体效果更佳（图2）。

图2 载体种类对嘴突凸脐蠕孢菌Y9511孢子萌发的影响Fig. 2 The effect of carrier types on the spore germination of E. rostratum Y9511

以珍珠岩作为载体时，设定的所有比例的孢子萌发率均高于对照，不同比例之间的萌发率几乎一致（图3）。当比例为1:1时，萌发率最高，为47.0%，故确定孢子粉（mg）与珍珠岩（mg）的添加比例为1:1。

图3 孢子粉与珍珠岩的比例对嘴突凸脐蠕孢菌Y9511孢子萌发的影响Fig. 3 The effect of the ratio of spore powder to perlite on the spore germination of E. rostratum Y9511

2.3 表面活性剂的筛选

表面活性剂的性质间接影响了嘴突凸脐蠕孢菌Y9511的生长。所有的表面活性剂均对菌株Y9511的菌丝体生长有着抑制作用，农乳1601#对其抑制作用不明显（图4）。在添加了农乳700#、农乳600#、农乳601#、农乳500#、BY-120#的PDA培养基中，其菌落直径大小与对照相比，有显著的抑制作用（P＜0.05)，农乳 500#抑制最严重，菌株基本不生长。从产孢量来看，除农乳 500#对产孢有极明显的抑制作用外，其余8种表面活性剂均对菌株的产孢有促进作用，其中，农乳700#的产孢量与对照相比有显著差异（P＜0.05)，产孢作用最好。综合两个指标，农乳1601#、吐温-80和农乳601#表现较好，可进行下一步操作。

图4 表面活性剂种类对嘴突凸脐蠕孢菌Y9511菌落直径和产孢量的影响Fig. 4 The effect of surfactant types on the colony diameter and spore production of E. rostratum Y9511

对农乳1601#、吐温-80和农乳601#进行分散力测定，三种表面活性剂的分散力存在显著差异（P＜0.05)。同浓度的三种表面活性剂中，农乳601#的I值为1.54，I值大于1，分散力较差；农乳1601#和吐温-80的分散力分别为0.35和0.89，I值均小于1，但农乳1601#的分散力更小，分散性能优于吐温-80。故选择农乳1601#作为表面活性剂。

农乳1601#在0.10%、0.50%、1.00%这三个浓度，孢子萌发率均低于对照（图5）。在0.30%这个浓度萌发率最高，为54.3%，且显著高于对照（P＜0.05)。结合分散力测定结果，0.10%、0.30%、0.50%、1.00%这四种浓度的分散力指数分别为 0.124、0.052、0.298、0.51，I值均小于 1，0.30%农乳 1601#分散指数 I为0.052，显著低于其他浓度的分散指数I，分散性能良好。故选择农乳1601#的浓度为0.30%。

图5 农乳1601#的浓度对嘴突凸脐蠕孢菌Y9511孢子萌发的影响Fig. 5 The effect of the concentration of Nongru 1601# on the spore germination of E. rostratum Y9511

2.4 油类助剂的筛选

本试验选用植物油作为油类助剂。添加不同油类助剂的培养基菌落直径均低于对照，但在产孢量上有差异。其中，大豆油、花生油能促进嘴突凸脐蠕孢菌Y9511的产孢，大豆油产孢量略高于花生油（图6）。葵花籽油、玉米油、稻米油则对嘴突凸脐蠕孢菌Y9511的产孢有抑制作用，葵花籽油的抑制效果最显著（P＜0.05)，产孢量只有0.67×106孢子/mL。而从孢子萌发率的结果看，孢子粉和油类助剂比例为2:1时，6种油类助剂均对孢子萌发有促进作用，且大豆油和花生油的促进效果几乎一致，无明显差异（图7）。但从市场成本考虑，大豆油的成本较低，综合以上指标，选择大豆油作为油类助剂。

图6 油类助剂对嘴突凸脐蠕孢菌落直径和产孢量的影响Fig. 6 The influence of oil additives on colony diameter and spore production of E. rostratum Y9511

图7 油类助剂种类对嘴突凸脐蠕孢菌Y9511孢子萌发的影响Fig. 7 The effect of oil additives on the spore germination of E. rostratum Y9511

大豆油与孢子粉的配比也会对孢子萌发有影响。图8展示了5种不同的配比，其中孢子粉（mg）:溶剂油（mL）＝1:3与对照相比无显著差异，其余配比均对孢子萌发起到促进作用，尤其是孢子粉（mg）:溶剂油（mL）＝2:1，萌发率达到75.67%。显著高于对照，因此将两者的配比确定为2:1时萌发效果最佳。

图8 孢子粉与大豆油的比例对嘴突凸脐蠕孢菌Y9511孢子萌发的影响Fig. 8 The effect of the ratio of spore powder to soybean oil on the spore germination of E. rostratum Y9511

2.5 106孢子/mL嘴突凸脐蠕孢菌Y9511悬浮液最大吸收波长确定

106孢子/mL菌株Y9511悬浮液在340～1000 nm的波长范围下，曲线先呈上升趋势，在360 nm处达到峰值，后呈下降趋势，由此可见，360 nm为其最大吸收波长（图9）。

图9 106孢子/mL嘴突凸脐蠕孢菌Y9511悬浮液在不同波长值下的吸光值Fig. 9 Absorbance values of E. rostratum Y9511 106 spores/mL suspension at different wavelengths

2.6 稳定剂的筛选

不同的稳定剂均对嘴突凸脐蠕孢菌Y9511的菌落直径有一定抑制作用，而在产孢量上，添加了CMC-Na的培养基产孢量远远比对照要高，而添加了海藻酸钠、海藻酸钾的培养基中，产孢量均与对照相接近，无显著性差异，可见CMC-Na对菌株Y9511产孢效果较好，而海藻酸钠、海藻酸钾对菌株Y9511产孢并无明显影响（图10）。

图10 稳定剂种类对嘴突凸脐蠕孢菌Y9511菌落直径及产孢量的影响Fig. 10 The effect of stabilizer types on the colony diameter and spore production of E. rostratum Y9511

360 nm为最大吸收波长，在此波长下，在不同时间内记录三种稳定剂的吸光度变化，拟合出四条曲线，比较稳定性。图11分别拟合了四条曲线：CK的K值为-0.0265、海藻酸钠的K值为-0.0147、CMC-Na的K值为0.0597、海藻酸钾的K值为0.0526。吸光值越大，表明溶质粒子对光的吸收越多。正斜率越小，说明孢子粉在溶液中较稳定；出现负斜率，说明孢子粉在逐渐下降，表现为对水的吸收，且负斜率越大，下降速度越快，稳定性越差。CK和海藻酸钠的曲线呈下降趋势，但海藻酸钠下降的幅度略小于CK，说明海藻酸钠对孢子起到一定稳定作用，但持续时间不长，后面的吸光值则表现为水分子对光的吸收。相反，海藻酸钾和CMC-Na的曲线呈上升趋势，海藻酸钾的斜率小于CMC-Na，说明海藻酸钾的稳定效果比CMC-Na好，孢子能短时间稳定在溶液体系中。三种稳定剂溶液随着放置时间增加，添加了海藻酸钠的孢子溶液孢子很快就沉底了，添加了CMC-Na的孢子溶液孢子出现分层现象，而添加了海藻酸钾的孢子溶液孢子仍能均匀、稳定分散在溶液中。最终选用海藻酸钾作为稳定剂。

图11 不同稳定剂的稳定性曲线Fig. 11 Stability curves of different stabilizers

不同浓度的海藻酸钾溶液的悬浮率是不同的。随着浓度上升，悬浮率也随之上升，在0.05%的时候，悬浮率几乎达到了80%（图12）。海藻酸钾的浓度影响孢子的萌发情况，孢子萌发率与浓度先呈正相关关系，然后呈负相关关系，浓度为0.10%时，孢子萌发率最高，明显比对照高，且与浓度0.30%没有显著性差异，0.50%以后的浓度，均抑制孢子萌发，孢子萌发率都显著低于对照（图13），但随着海藻酸钾的添加量增多，溶液变得越来越稠，可能会对孢子长时间放置产生一定的影响。结合两个图的数据和实际现象，最终将海藻酸钾的浓度确定为0.10%。

图12 不同浓度的海藻酸钾的悬浮率变化Fig. 12 Suspension rate changes of different concentrations of potassium alginate

图13 海藻酸钾的浓度对嘴突凸脐蠕孢菌Y9511孢子萌发的影响Fig. 13 The effect of the concentration of potassium alginate on the spore germination of E. rostratum Y9511

3 讨论

选择良好的助剂，对于微生物农药制剂的开发至关重要。载体是微生物农药的主要辅助成分，制剂的一些性能指标，如悬浮稳定性和润湿性等，在很大程度上取决于载体的相关性质[19]。嘴突凸脐蠕孢菌的孢子粉如果长时间放置，就会粘结在一起，分散性和流动性相对较差，喷洒时因分布不均匀而造成同点侵染。本试验中，珍珠岩促产孢的效果最为明显，可能是因为珍珠岩作为一种惰性载体，能改善微生物的生长环境，延长孢子存活期限[20]。Fargues等[21]的试验也得到了相似的结论。具体机制还需要进一步研究。

在农药使用过程中，表面活性剂有利于液滴在植物叶片形成最佳接触角，使液滴不易从植物叶片滑落，渗透力度加大等，减少对农药的浪费[22-24]。但是，随着表面活性剂浓度的增加，反而会抑制孢子萌发，我们不仅要选用合适的表面活性剂，还要注意其最适浓度。在本试验中，农乳500#几乎完全抑制嘴突凸脐蠕孢菌Y9511生长，农乳 500#分子结构式为(C12H25C6H4SO3)2Ca，含有钙元素，俞雯雯等[8]通过制备缺磷、硫、钾、铁、镁培养基探究对嘴突凸脐蠕孢菌Y9511菌落直径和产孢量的变化，但尚未制备缺钙培养基，所以钙元素是否抑制Y9511生长还需要做进一步探究。本试验目前只研究了一种表面活性剂的添加对嘴突凸脐蠕孢菌Y9511的影响，如有需要，可以考虑将所选的表面活性剂进行复配，增强乳化分散性。

嘴突凸脐蠕孢菌的体积较大，分生孢子为（50～120）×（12～22）μm[7]，如果长时间放在溶液中，会因为它自身的重力作用而沉淀下来，而且喷洒到环境中，可能会因为外界因素而出现性能下降等问题，所以，在制剂中需要添加一定量的稳定剂，不仅能使孢子较长时间内均匀悬浮在溶液中，还能在喷洒时，避免性能下降。本试验中，0.1%的海藻酸钾能在短时间内使孢子均匀分散在油基中，但只测了1 h内吸光值，室温放置了2 h，为了商品化生产，要保证孢子粉能长时间悬浮稳定，所以还需要延长放置时间。

本试验只是筛选出了最佳的助剂，但还没有得到最优配方组合，且未对配制而成的制剂进行室内防效测定。若要进行商品化生产，孢子粉的固体发酵必须要扩大培养，可以进一步优化固态发酵的方法[25]。