混合菌发酵臭鳜鱼工艺优化

马晓飞， 黄 宁， 梁钻好， 杜 冰

（1. 华南农业大学食品学院，广东 广州 510642； 2. 阳江职业技术学院食品与环境工程系，广东 阳江 529566）

0 引言

臭鳜鱼，徽州名菜，起源于200 多年前，沿江一带鱼贩入冬时把新鲜鳜鱼（又名桂鱼、桂花鱼）用木桶装运至徽州出售，路途需七八天，便以盐抑腐，经常上下翻动，如此便有一种似臭非臭的特殊气味，但鱼形态完整，洗净后经热油稍煎再细火烹饪，肉质鲜香，醇滑爽嫩。后来如此脍炙人口的佳肴便延续至今。臭鳜鱼以“闻臭吃香”为特色，近几年随着鳜鱼养殖技术提升而走红。但臭鳜鱼的加工还是以沿用传统自然发酵方式的小作坊为主，存在品质和风味不可控、发酵周期长、高盐、微生物超标、食用安全性受质疑等现象[1-2]。臭鳜鱼的加工技术还没有一个根本性的革新。

发酵过程是微生物菌群进行选择和富集的过程，对臭鳜鱼关键风味的形成具有决定性作用[3]。大量研究表明，乳酸菌是自然发酵臭鳜鱼的优势菌群，通过分泌蛋白酶作用于鱼肌肉蛋白，促进小分子多肽和游离氨基酸的释放，这些小分子多肽和游离氨基酸不仅是重要的呈味物质，而且也是某些重要特征风味物质的前体物质，在发酵后期会进一步形成风味物质[4-7]。乳酸菌还能抑制臭鳜鱼储藏后期挥发性盐基氮、硫代巴比妥酸值和生物胺的积累[8]。如清酒乳杆菌可明显降低鱼肉甲硫醇等恶臭气味的产生，同时促进芳樟醇、α-松油醇、α-蒎烯和柠檬烯等香气物质的生成，显著提升臭鳜鱼风味，同时抑制杂菌生长[9-10]。人工添加优势菌干预臭鳜鱼发酵，一方面可定向改善和提升臭鳜鱼风味，另一方面可使整个加工环节和食品安全具有可控性。

产乳酸芽孢杆菌DU-106（Bacillussp. DU-106）为蜡样芽孢杆菌属的一个新亚种，其特点是兼性厌氧，在有氧环境下也能表现出极强的繁殖能力，高产L-乳酸，经研究具有良好的免疫活性和肠道益生菌特性，应用于中草药和果蔬发酵饮料中已表现出极大的优势，关注度不断提高[11-18]。本课题拟采用产乳酸芽孢杆菌DU-106 复配中国根霉12 发酵臭鳜鱼，利用中国根霉高产脂肪酶催化短链脂肪酸合成芳香酯类物质的特点，丰富和柔和臭鳜鱼的“臭”味，助力乳酸菌和中国根霉在水产品发酵中的应用[19]。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

新鲜鳜鱼、生姜，购于阳江市木赉市场。

产乳酸芽孢杆菌DU-106 冻干粉（活性为3×1010cfu/g）和中国根霉12，均由华南农业大学新资源食品与功能性原料研究及评价中心提供；葡萄糖粉、可溶性膳食纤维、菊粉、花椒粉、小红椒粉、茴香粉、白糖和味精，均为食品级。

中国根霉12 活化斜面培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，121 °C 灭菌20 min。

中国根霉12 扩大培养液体培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL，121 °C 灭菌20 min。

SW-CJ-2F 型超净工作台（广州瑞智净化设备有限公司）；YXQ-LS-50SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；LAB254e 型电子精密天平（艾德姆衡器（武汉）有限公司）；MAXQ6000型低温摇床（广州源起健康科技有限公司）；SPX-250BⅢ型生化培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程及关键控制点

工艺流程：新鲜鳜鱼→清洗净膛→接种（添加辅料）→发酵→清洗→臭鳜鱼成品。

关键控制点如下。

（1）清洗净膛。鲜活鳜鱼，去鱼鳃、鱼鳞和内脏，鱼酮体用清水冲洗干净至无血丝，沥干，称量，质量约（500 ±100 ）g。

（2）辅料配比。花椒粉10 g、小红椒粉20 g、茴香粉5 g、剁碎的生姜10 g、白糖10 g、味精5 g，临用前混合均匀。

（3）根霉菌液。接种1-2 环中国根霉12 保藏菌种至PDA 培养基中，32 °C 静置培养3 d，马铃薯液体培养基接种后32 °C 振荡培养3 d。

（4）乳酸菌粉。6 g 产乳酸芽孢杆菌DU-106 冻干粉、77 g 葡萄糖粉、7 g 可溶性膳食纤维、10 g 菊粉，混合均匀；使用前先用15 mL 无菌生理盐水30 °C 活化30 min。

（5）发酵。按一定比例接种根霉菌液和乳酸菌粉，添加盐和辅料，15 °C 恒温恒湿箱中发酵一定时间；期间每天翻一次鱼身，3 d 后倒掉多余的浸出液。

（6）清洗。发酵结束后用无菌水清洗鳜鱼酮体，真空包装，-18 °C 保存。

1.2.2 臭鳜鱼加工单因素试验

加盐量对臭鳜鱼感官评价的影响：分别将0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%的食盐与0.5%辅料、6.0%根霉菌液、3.0%乳酸菌粉混合均匀后涂抹在清洗干净的鳜鱼酮体表面，至于密封容器中，15 °C 发酵8 d。

根霉菌液接种量对臭鳜鱼感官评价的影响：分别将0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%的根霉菌液与2.0%食盐、0.5%辅料、3.0%乳酸菌粉混合均匀后涂抹在清洗干净的鳜鱼酮体表面，至于密封容器中，15°C 发酵8 d。

乳酸菌粉添加量对臭鳜鱼感官评价的影响：分别将1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的乳酸菌粉与2.0%食盐、0.5%辅料、6.0%根霉菌液接种量混合均匀后涂抹在清洗干净的鳜鱼酮体表面，至于密封容器中，15 °C发酵8 d。

发酵时间对臭鳜鱼感官评价的影响：将2.0%食盐、0.5%辅料、6.0%根霉菌液和3.0%乳酸菌粉混合均匀后涂抹在清洗干净的鳜鱼酮体表面，至于密封容器中，15 °C 分别发酵6、8、10、12、14 d。

1.2.3 臭鳜鱼加工工艺优化试验

经单因素试验，认为根霉菌液接种量对臭鳜鱼感官评价无显著影响，故以加盐量、乳酸菌粉添加量和发酵时间为自变量，感官评分为响应值，采用响应面 Box-Behnken 中心组合设计法对臭鳜鱼加工工艺进行优化，分析各因素间的交互作用，确定最佳的加工工艺条件。

1.2.4 感官评价

对臭鳜鱼的气味、鱼肉组织状态和口感进行评价，其中气味是以生鱼作评价，鱼肉组织状态和口感是以熟鱼（清蒸，武火至水沸后转文火蒸10 min）作评价。

10 分制感官评分细则如表1 所示。选取12 名腌制水产品评价专家进行感官评价，得到的结果去除最高值和最低值后取平均值。

表1 臭鳜鱼感官评分细则Tab. 1 Sensory scoring rules of stinky mandarin fish

风味剖面检验分析法：对风味（酸味和臭味）、肉质（弹性和蒜瓣状）、滋味（咸味和酸味）采用6 分定义的标度方法（1-不存在的；2-非常轻微的；3-轻微的；4-明确的；5-显著的；6-非常显著的）对臭鳜鱼样品进行强度评价，并进行风味剖面检验分析[20]。

1.2.5 数据处理

采用WPS Office 2019 处理数据，并用Origin 8.0 软件对数据进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 加盐量对臭鳜鱼感官评分的影响

臭鳜鱼腌制过程中，食盐起到的最主要作用是防腐，其次才是调味和改变肉质口感。如图1 所示，随着食盐的增加，臭鳜鱼的气味略有减弱，蒜瓣状增强，咸味加重，腐味减弱，总体感官评分先增后减，并在1.0%～2.0%的添加量达到最佳感官评分。腌制期间，食盐渗透到鱼体，鱼肌肉细胞脱水，促进形成骨肉分离的蒜瓣肉。食盐添加量过少，不利于蒜瓣肉的形成；添加量过多，鱼肌肉严重脱水，鱼肉变柴失去弹性，味道太咸，掩盖了其他滋味，严重影响口感，而且盐分过高也会一定程度上抑制优势菌的繁殖。

图1 加盐量对臭鳜鱼感官评分的影响Fig. 1 Effect of salt dosage on sensory score of stinky mandarin fish

2.2 根霉菌液接种量对臭鳜鱼感官评分的影响

根霉菌液接种量对臭鳜鱼感官评分的影响如图2 所示。相比不添加根霉（接种量为0），少量接种根霉后，臭鳜鱼感官评分显著提高。根霉接种量为2.0%～8.0%时，臭鳜鱼感官评分徘徊在6.0～7.5 分，属于中等级别。当接种量增加至10.0%时，臭鳜鱼开始出现明显的恶心腐臭味，感官评分骤然下降至（4.3±0.2）分的不合格等级。即根霉菌液接种量较少（2.0%～6.0%）时，接种量对臭鳜鱼感官评分无显著影响，考虑经济因素，根霉菌液以2%接种量为宜。

图2 根霉菌液接种量对臭鳜鱼感官评分的影响Fig. 2 Effect of Rhizopus inoculation amount on sensory score of stinky mandarin fish

单纯乳酸菌发酵，发酵速度较慢，发酵8 d 后“臭”味仍不明显，但添加根霉后，臭鳜鱼的“臭”味变得显著，即根霉有助于加速发酵，一定程度上提升产品风味。但乳酸菌和根霉之间有一个协同发酵的比例，超出范畴，二者可能会产生拮抗和抑制作用[21]。因此，根霉添加量太大，繁殖速度过快，臭鳜鱼的臭味就会变得过重，鱼肉出现腐烂。

2.3 乳酸菌粉添加量对臭鳜鱼感官评分的影响

乳酸菌粉添加量对臭鳜鱼感官评分有显著影响。如图3 所示，添加量从1.0%增加至5.0%，臭鳜鱼感官评分呈阶梯式下降。添加量为1.0%和2.0%时，臭鳜鱼具有发酵后的特殊酸臭味，肉质嫩滑，骨肉分离，蒜瓣状明显，口感略带酸味，感官评分接近优良；添加量增加至3.0%和4.0%时，臭鳜鱼酸臭味加重，肉质的嫩滑度下降，有蒜瓣状但不明显，酸味口感突出，感官评分下降；当添加量5.0%时，臭鳜鱼的酸味、酒精味冲鼻，肉质变柴，酸腐味明显。乳酸菌粉最佳添加量为1.0%～2.0%。

图3 乳酸菌粉添加量对臭鳜鱼感官评分的影响Fig. 3 Effect of addition amount of lactic acid bacteria powder on sensory score of stinky mandarin fish

产乳酸芽孢杆菌DU-106 兼性厌氧，在有氧的环境下也能高质量繁殖：一方面产生以乙偶姻为代表的具有发酵奶酪味的挥发性成分，使臭鳜鱼的“臭”味更具层次感；另一方面高产的L-乳酸可赋予臭鳜鱼柔和的酸味口感，同时形成抑制杂菌的酸性环境。然而乳酸菌的过度繁殖及乳酸蓄积过多，鱼肉pH 值下降明显，会导致蛋白质聚集、变性，表现为肌肉持水性下降，保水性变差，鱼肉嫩度下降，肉质变柴。

2.4 发酵时间对臭鳜鱼感官评分的影响

发酵是臭鳜鱼特征风味逐渐成熟的过程，因此发酵时间是影响臭鳜鱼感官评分的一个重要指标。发酵时间不够，鱼肉蛋白质未能充分水解呈多肽和氨基酸，风味前提物质积累不足；发酵时间过长，微生物繁殖过盛，鱼肉又会腐烂变质。如图4 所示，发酵时间8～10 d 为宜。

图4 发酵时间对臭鳜鱼感官评分的影响Fig. 4 Effect of fermentation time on sensory score of stinky mandarin fish

2.5 臭鳜鱼加工工艺优化

根霉菌液接种量对臭鳜鱼感官评价影响不显著，直接固定根霉菌液接种量为2%，选取加盐量、乳酸菌粉添加量、发酵时间3 个因素为自变量，感官评分为响应值，根据Box-Behnken 中心组合设计原理，设计3 因素3 水平、15 个试验点的响应面分析试验，因素水平编码如表2 所示，试验结果如表3 所示。

表2 因素和水平编码值Tab. 2 Orthogonal test factors and levels

利用Design-Expert Version 10.0.7 中的响应面设计法（RSM）对表3 试验数据进行多元回归拟合，去除不显著变量，得到自变量与臭鳜鱼感官评分（Y）二次多项回归模型为

表3 响应面设计与试验结果Tab. 3 Response surface design and experimental results

回归方差分析显著性检验（表4）表明，该回归模型P<0.01，回归方程模型达到极显著水平，失拟项P=0.070>0.05，不显著；该回归模型的总决定系数R2=0.817 0，调整决定系数R2Adj=0.928 3，说明该模型的拟合程度较好，试验误差较小，因此该回归方程模型能较好地对臭鳜鱼加工工艺进行分析及预测。影响臭鳜鱼感官评分的主次因素顺序为发酵时间>乳酸菌粉添加量>加盐量。其中发酵时间（X3）达到极显著水平（P<0.01），乳酸菌粉添加量（X2）达到显著水平（P<0.05），加盐量（X1）影响不显著（P>0.05）。

表4 回归方程模型方差分析Tab. 4 Variance analysis of regression equation model

臭鳜鱼的最优加工条件为加盐量1.4%、辅料添加量0.5%、根霉菌液接种量2%、乳酸菌粉添加量1.4%、15 °C 发酵8 d。在该条件下，臭鳜鱼感官评分的理论值可高达9.49 分。在此条件下进行验证试验，得到的臭鳜鱼气味带酸带臭，气味浓郁但不刺鼻，肉质嫩滑，呈骨肉分离的蒜瓣状，口感咸味适中，微酸，肉质鲜美无明显腐味。总体感官评分为（9.40± 0.42）分，与理论预测值的相对误差仅为0.95%。

2.6 臭鳜鱼风味剖面分析

采用风味剖面检验分析法对接种发酵臭鳜鱼和对照组自然发酵臭鳜鱼（加盐量1.4%、辅料添加量0.5%、15 °C 发酵8 d）的风味、滋味、口感进行6 点评分，结果如图5 所示。两种方式得到的臭鳜鱼风味差异较大，对照组腐、臭、腥味显著，而且尖锐刺鼻；接种发酵组臭味虽浓郁，但相对柔和，带有酸味、臭味、香味，细闻具有明显的层次感。滋味方面也有明显区别，接种发酵组比对照组增加了酸味，产乳酸芽孢杆菌DU-106 繁殖产乳酸，以及微生物代谢酶对鱼肉蛋白的水解作用，促进了呈味氨基酸的释放，酸味、甜味、鲜味、苦味的增加会削弱咸味和腥味，因此二者的咸味表现感与加盐量并不完全一致[22]。接种发酵组的蒜瓣状形成效果也明显优于对照组，这表明接种中国根霉12 和产乳酸芽孢杆菌DU-106 能有效促进鱼肉形成蒜瓣状肉质。

图5 臭鳜鱼风味剖面检验分析结果Fig. 5 Results of flavor profile inspection and analysis of stinky mandarin fish

3 结论

接种中国根霉12 和产乳酸芽孢杆菌DU-106 混合发酵制备臭鳜鱼，可定向改善臭鳜鱼风味。在单因素试验的基础上进行响应面优化，得出最优加工工艺条件为加盐量1.4%、根霉菌液接种量2%、乳酸菌粉添加量1.4%、15 °C 发酵8 d。此条件下得到的臭鳜鱼感官评分为9.4，属于优良级别。相比臭味刺鼻的自然发酵臭鳜鱼，接种发酵的臭鳜鱼风味和滋味上增加了酸味，更有利于蒜瓣状肉质的形成，酸臭味丰富浓郁而柔和、富有层次感。中国根霉12 和产乳酸芽孢杆菌DU-106可应用于臭鳜鱼发酵。