高效液相色谱法检测糖浆剂药品中爱德万甜不确定度评定

雷德卿 钟菲菲 周金沙 刘 波 王子倩 周亚敏

(长沙市食品药品检验所，湖南 长沙 410008)

人工合成甜味剂是一类应用较广泛的食品添加剂[1]，过量摄入可能损害身体健康[2-3]，尤其是肝肾发育不成熟的儿童，造成的损伤可能不可逆[4]。相对来源于天然产物的药用级蔗糖，作为食品添加剂的人工合成甜味剂价格低廉，个别企业为了非法牟利，将食品甜味剂添加到药品中减少药用蔗糖量，严重损害患者尤其是儿童身体健康。

常用的食品甜味剂主要有糖精钠、安赛蜜、甜蜜素、阿斯巴甜等[1]，检测手段比较多，如毛细管电泳法、离子色谱法、气相色谱法、液相色谱法、液质联用法等[5-9]。爱德万甜是近年使用较广泛的甜味剂新兴品种，国家市场监督管理总局于2022年发布了食品中爱德万甜补充检验方法[10]。食品甜味剂用于食品的研究较多，而用于药品的研究较少[11-12]，目前尚未见爱德万甜非法添加到药品糖浆剂的文献或补充检验方法。研究拟在建立高效液相色谱法的基础上，依据《测量不确定度评定与表示》等资料[13-16]，试图对该法进行测量不确定度分析，探讨误差来源及各分量大小，并提出相应建议，以期为减少测量误差、提高测量准确度提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

乙腈：色谱纯，美国默克公司；

其余试剂均为分析纯；

超纯水：自制；

爱德万甜标准物质：含量97.0%，美国Sigma公司；

小儿止咳糖浆样品：来源于21家生产企业共45批次，市售。

1.1.2 主要仪器设备

高效液相色谱仪：Waters alliance e2695型，配有自动进样器、DAD检测器，美国沃特斯公司；

电子分析天平：METTLER XS205DU型，瑞士梅特勒—托利多公司；

纯化水系统：Millipore Milli-Q Direct 8型，美国密理博公司。

1.2 方法

1.2.1 样品溶液的制备 精密量取样品5 mL至50 mL量瓶，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，弃去初滤液10 mL，取续滤液。

1.2.2 标准溶液的制备 精密称取爱德万甜标准物质25.21 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液，用10 mL刻度吸管精密量取贮备液0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mL分别置100 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为标准曲线工作溶液，每1 mL含爱德万甜约2，5，10，20，50，100 μg。

1.2.3 液相色谱条件 Shiseido AQ-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) 色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.02 mol/L 磷酸二氢铵(用三乙胺调节pH至5.5±0.05)为流动相B，梯度洗脱(洗脱程序见表1)，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，检测波长214 nm，进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure

1.2.4 数学模型建立

P=C×V1/V2，

(1)

式中:

P——样品中爱德万甜含量，μg/mL；

C——爱德万甜在样品溶液中的质量浓度，μg/mL；

V1——样品定容体积，mL；

V2——样品量取体积，mL。

1.2.5 不确定度来源分析 分析爱德万甜检测方法与含量计算数学模型，不确定度的主要影响因素有标准溶液制备(包括称量和稀释)、标准曲线拟合、样品溶液制备(包括量取、稀释、包含随机误差的回收率)、样品测量重复性等。

2 结果与分析

2.1 标准溶液制备不确定度

2.1.1 称量不确定度 标准物质称量不确定度u(m)来源于称量误差u(m1)及称量重复性u(m2) 2个分量。

合成上述2个分量，得到标准物质称量不确定度：

标准物质称量相对不确定度为u(m)/m=0.010/25=0.000 40。

2.1.2 稀释不确定度 精密称取爱德万甜标准物质于25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，作为贮备液，再用10 mL 分刻度吸管精密量取不同体积贮备液分别至100 mL 量瓶中，制备系列标准工作溶液，不确定度来源于10 mL刻度吸管误差、25 mL容量瓶误差、100 mL容量瓶误差3个分量。

稀释的相对不确定度由上述3个分量合成得到：

查阅标准物质证书，因未给出赋值的不确定度，故忽略不计。标准溶液制备不确定度由称量相对不确定度与稀释相对不确定度合成得到：

2.2 标准曲线拟合不确定度

取质量浓度分别为1.956，4.891，9.781，19.56，48.91，97.81 μg/mL 的标准溶液(共6个浓度点)进样，平行进样2针，用最小二乘法拟合线性方程y=a+bc及相关系数(r)[15]。样品测定9次，样品中爱德万甜平均质量浓度为73.98 μg/mL。按贝塞尔公式计算标准差：

因此标准曲线拟合带入的标准不确定度为：

2.3 样品溶液制备不确定度

用5 mL单刻度移液管精密量取样品溶液至50 mL量瓶中，加50%甲醇稀释定容，取续滤液即为样品溶液，故不确定度包含3个分量：5 mL移液管不确定度、50 mL量瓶不确定度、包含人员操作等随机误差的回收率不确定度。

(3) 回收率不确定度:分析人员熟练程度、过滤时弃去初滤液的量、过滤时溶剂挥发等引起的不确定度，通过加标回收试验评价[15]。按爱德万甜在样品中含量的80%，100%，120%分别添加标准溶液测定样品加标回收率，每个梯度测定3份，共9份，回收率分别为102.4%，102.4%，98.8%，103.6%，104.8%，101.7%，102.1%，101.5%，102.6%，平均为102.2%，RSD为1.7，回收最大值与平均值偏差b+=104.8%-102.2%=2.6%，平均值与最小值偏差b-=102.2%-98.8%=3.4%。则回收不确定度为：

合成上述3个分量，即得到样品溶液制备不确定度：

2.4 样品重复测定不确定度

样品重复测定9次，爱德万甜含量分别为76.5，77.2，74.3，74.1，72.4，70.4，73.6，74.2，73.1 μg/mL，平均含量为74.0 μg/mL，标准偏差s=2.1。样品重复测量相对标准不定度为

2.5 合成不确定度

合成标准溶液制备不确定度、标准曲线拟合不确定度、样品溶液制备不确定度、样品重复测定不确定度4个分量，即得到该法测定糖浆剂药品中爱德万甜含量的不确定度

U(v)=74.0×0.018=1.3 μg/mL。

以95%为置信限，包含因子k=2，计算扩展不确定度U=k×U(v)=2×1.3=2.6 μg/mL。则该批次小儿止咳糖浆样品中爱德万甜含量为(74.0±2.6) μg/mL。

2.6 不确定度影响因素分析

综上，爱德万甜测量不确定度来源见图1，各影响因素按大小依次为样品溶液制备(0.014)、样品测量重复性(0.009 5)、标准曲线拟合(0.004 9)、标准溶液制备(0.004 3)。标准溶液制备操作步骤简单，仅包含了容量仪器带入的系统误差，不确定分量较小。而样品溶液制备、样品测量重复性、标准曲线拟合不仅包含仪器设备带入的系统误差，也包括偶然误差，因此相对较大。试验时，为确保测定结果准确，应通过控制实验室温湿度恒定、使用检定合格并清洁的器具、调试仪器设备达到最优状态、多次重复测定、提高技术人员分析水平等方面减少偶然误差。

图1 不确定度来源分析Figure 1 Analysis for source of uncertainty

3 结论

试验表明,样品溶液制备引入的不确定度(0.014)最大。高效液相色谱法测定小儿止咳糖浆中爱德万甜含量的不确定度来源主要有：① 玻璃容器、量器不准确带入的误差，为了减少误差，应使用经校准符合要求的玻璃容器、量器，移液管使用前用待量取的溶液润洗3次以上；② 环境影响，试验过程中，尽量保持环境温湿度恒定，试验用的样品、溶剂、玻璃器皿等放入实验室一定时间与室温保持一致，可以有效降低试验环境带入的误差；③ 试验人员读数误差，可以通过不断提高分析人员水平降低误差；④ 样品过滤带入的误差，微孔滤膜、定量滤纸对待测成分都有一定程度的吸附作用，样品过滤时，弃去初滤液，使滤膜或滤纸吸附达到饱和后，再接取续滤液用于试验，可以有效消除或降低过滤带入的误差。