人磷酸甘油酸变位酶1在大肠杆菌中的表达及纯化*

金科华

(1.湖北科技学院医学部医药研究院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院医学部基础医学院)

有氧糖酵解是很多肿瘤细胞的重要特征之一，抑制有氧糖酵解是富有前景的抗肿瘤策略[1]。磷酸甘油酸变位酶(phosphoglycerate mutase 1，PGAM1)是糖酵解途径的重要酶，催化3-磷酸甘油酸和2-磷酸甘油酸之间的互变，协调糖酵解、丝氨酸生成和磷酸戊糖途径[2]，研究表明PGAM1高表达与多种肿瘤的发生发展密切相关[3-4]，可抑制PGAM1的活性[5-9]或降低其表达水平[10]，阻碍肿瘤细胞生长。本研究利用重组DNA技术，在大肠杆菌中表达和纯化PGAM1，为后续抑制剂的筛选和其他研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 宿主菌和主要试剂

大肠杆菌、HiFi DNA Polymerase、DNA marker购自北京全式金生物技术公司。PGAM1 cDNA由厦门大学韩家淮院士馈赠。卡那霉素、IPTG、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。限制性核酸内切酶购自NEB公司。DNA连接试剂盒购自TaKaRa公司。His-Tag蛋白纯化试剂盒(可溶性)购自康为世纪生物科技有限公司。BCA蛋白质定量测定试剂盒购自Bio-sharp公司。截流分子量10kd超滤管(15mL)购自Millipore公司。

1.2 扩增PGAM1 cDNA

设计引物。利用SnapGene软件设计扩增PGAM1 cDNA的引物。正向引物PF序列为：CGACATATGATGGCCGCCTACAAACTGG；反向引物PR序列为：AGTCTCGAGTCACTTCTTGGCCTTGCCC。下划线标记的序列分别为Nde I和Xho I位点。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

获取cDNA模板。将含PGAM1 cDNA的菌液按1∶100接种于含100μg/mL氨苄青霉素的LB，37℃，220r/min培养24h，按质粒抽提试剂盒提取含PGAM1 cDNA的未知质粒。

PCR扩增cDNA。PCR体系：cDNA模板1μL,引物PF(10μmol/L)和PR(10μmol/L)各1μL，10×HiFi Buffer Ⅱ 5μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，HiFi DNA Polymerase 0.5μL,H2O 37.5μL。PCR参数：95℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延长1min，循环30次；72℃延长10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收试剂盒纯化。

1.3 酶切、连接与转化

按表1酶切cDNA与pET-28a。酶切产物行琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化。取酶切纯化的cDNA、pET-28a 各2.5μL与DNA连接试剂I 5μL，混匀，于16℃连接1h。按DH5α感受态细胞说明书，将连接产物进行热激转化，并于含卡那霉素的LB平板(LBK平板)筛选抗性菌落。

表1 DNA的酶切

1.4 鉴定重组质粒

重组质粒pET-28a-PGAM1(记为28a-PAM)按表1酶切，产物于0.8%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。酶切鉴定与预期相符重组质粒送华大基因测序。

1.5 IPTG诱导PGAM1表达与纯化

按1.3的方法，将28a-PAM转化BL21(DE3)细胞，挑抗性单菌落接种于5mL LBK培养基，37℃ 220r/m培养过夜。取过夜培养的菌液1mL接种于100mL LBK培养基，37℃ 220r/m培养至OD600为0.86，加入终浓度0.1mmol/L IPTG,16℃诱导培养24h。12 000r/min,4℃离心收集菌体。加10mL细菌蛋白抽提缓冲液(含1mmol/L PMSF)重悬细胞，以260W超声10s停10s的程序，超声1h裂解细胞。细胞裂解液于12 000r/min，4℃离心10min。将上清与等体积的不含咪唑的Binding Buffer混匀，得混合液。取1.5mL Ni2+填料，装入重力纯化柱，按说明书洗涤与平衡。在4℃冰箱纯化PGAM1：将混合液加入纯化柱，纯化柱出口连接一次性输液器管，调节流速至0.5mL/min，流出未结合蛋白。分别用含20、40mmol/L咪唑的Binding Buffer各40mL洗涤填料上的非特异性结合蛋白，再用20mL Elution Buffer洗脱PGAM1。

将纯化的PGAM1装入截留分子量10KD的超滤管，4℃ 4 000×g离心浓缩至1mL，加入9mL不含咪唑的Binding Buffer稀释浓缩液，再次离心浓缩至1mL，重复稀释—浓缩6次，彻底降低PGAM1溶液中的咪唑浓度。

取10μL浓缩的PGAM1，用PBS稀释10倍，按BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定PGAM1浓度。向剩余PGAM1中加入终浓度2mmol/L PMSF后与等体积的甘油混匀，分装后保存于-20℃，备用。

2 结 果

2.1 PGAM1 cDNA的PCR扩增

PCR产物电泳结果如图1，PCR扩增后有略大于750bp的条带，与PGAM1 cDNA分子量(765bp)相符(泳道1)，阴性对照无扩增条带(泳道2)。

M:DL2000 DNA marker；1:PGAM1 cDNA PCR产物；2:阴性对照PCR产物

2.2 重组质粒的鉴定

2.2.1 酶切鉴定

重组质粒28a-PAM经NdeI+Xho I酶切后出现两种DNA片段。大片段与pET-28a经相同酶切的产物(图2泳道1)相符，小片段(图2泳道2)与PGAM1 cDNA分子量(765bp)吻合。可知PCR产物已插入pET-28a质粒中。

M1:1kb DNA marker；1:pET-28a Nde I+Xho I酶切产物；2:pET-28a-PGAM1 Nde I+Xho I酶切产物；M2:DL2000 DNA marker

2.2.2 测序鉴定

重组质粒DNA测序结果表明连入pET-28a中的序列与cDNA序列一致，读码正确，正向测序的部分信号峰如图3所示。蓝色下划线序列为pET-28a Nde I位点，红色箭头序列为PGAM1的起始密码子编码序列。

图3 pET-28a-PGAM1部分测序峰图

2.3 PGAM1的表达与纯化

PGAM1表达产物如图4所示。0.1mmol/L IPTG诱导的28a-PAM-BL21(DE3)裂解液上清中有一条介于25～35Ku粗带(泳道2)，与PGAM分子量(29Ku)相符，未经IPTG诱导的菌体无此条带(泳道1)，可见PGAM获得了可溶性表达，经Ni2+纯化的PGAM1杂带少，纯度高。PGAM1经超滤浓缩和缓冲液交换后，测定其浓度约为12mg/mL，可知PGAM的表达量约120mg/mL。

M:蛋白质Marker；1：28a-PAM-BL21(DE3)未经IPTG诱导的上清；2：28a-PAM-BL21(DE3)0.2mmol/L IPTG诱导的上清；3：纯化的PGAM1

3 讨 论

PGAM1在多种肿瘤细胞中高表达，宋宜鹏等[11]发现PGAM1在胃癌组织的表达水平明显高于癌旁组织，与胃癌临床病理特征相关。近年已有研究认为PGAM有望成为肿瘤治疗的靶点在[1]。Wang等[12]合成了一系列基于N-氧杂蒽酮酰胺基苯磺酰胺母核的PGAM1的抑制剂，其中编号为15h的化合物对PGAM1抑制活性最强，IC50约2.1μmol/L，细胞实验表明，15h能有效抑制人非小细胞肺癌H1299细胞的增值。Liang等[6]发现小分子化合物HBK99通过别构抑制PGAM1，能逆转非小细胞肺癌细胞对埃罗替尼的抗性。

本研究构建了PGAM1的原核表达载体pET28a-PGAM1，并在宿主菌BL21(DE3)中获得了可溶性PGAM，产量达120mg/mL。通过大体积低浓度咪唑溶液的反复洗涤，有效去除杂蛋白，保证PGAM1的高纯度。为避免咪唑对PGAM1浓度测定及酶活性的影响，本文采用反复超滤—缓冲液交换的策略，彻底降低PGAM1溶液中残存咪唑的浓度，为后续酶活性的测定、抑制剂的筛选、蛋白质结晶和其它功能的研究奠定了坚实的基础。

PGAM1在LKB培养基中，通过低浓度IPTG(0.1mmol/L)，16℃诱导培养24h，产量已达到120mg/mL，足够后续研究对酶量的需求，无需进一步优化其它表达条件。