经典名方当归建中汤HPLC 指纹图谱及含量测定方法研究

张瑞彤，王 莹，熊 辉，孙 晖，张喜武，王喜军

（黑龙江中医药大学，教育部经典名方有效性评价及产业化开发工程研究中心，国家中医方证代谢组学研究中心，黑龙江 哈尔滨 150040）

当归建中汤（DJD）源自唐代孙思邈《千金翼方》[1]，列入国家颁布的《古代经典名方目录（第一批）》[2]。DJD 由当归、白芍、桂枝、炙甘草、大枣、生姜配伍而成，君药当归有补血活血之效，桂枝、白芍共作辅药，前者辛温益气，后者滋养阴血，炙甘草补中扶虚，既可助长补益脾胃之气，又可解白芍寒凉，缓解急性疼痛，大枣和生姜可温中补脾[3]，诸药合用，共同发挥养血复脉、温经散寒的功效[4-6]。现代临床应用DJD 辨证施治，对原发性痛经、产后腹痛、胃溃疡等均有确切疗效。

基准样品承载了古代经典名方的有效性、安全性，质量研究成为古代经典名方复方制剂开发的重要内容和关键环节，而指纹图谱和含量测定是控制基准样品质量的主要方法。中药化学指纹图谱利用色谱、波谱等现代分析技术对中药化学成分进行整体表征，综合评价中药整体质量，有效保障了中药质量的稳定性。同时，筛选与经典名方有效性、安全性相关的质量标志物，建立含量测定方法，可定量表征基准样品质量。课题组前期利用中医方证代谢组学技术[7-8]明确了DJD 的效应关联成分，主要为阿魏酸、芍药苷、肉桂酸、甘草苷等[9]。本研究在此基础上，利用HPLC 法建立DJD 基准样品的指纹图谱分析方法以及相关指标成分的含量测定方法，为古代经典名方DJD 复方制剂的研究奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

2010-AHT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；2996 型紫外检测器（美国Waters 公司）；CP225D 型电子天平（德国赛多利斯公司）；ModulyoD-230 型真空冷冻干燥机（美国Thermo Savant 公司）；Sorvall ST 16R 型冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；RODI-220A1 型水纯化系统（厦门锐思捷水纯化技术有限公司）。

1.2 试药

对照品阿魏酸（批号：110773-201614，纯度：99.0%）、芍药苷（批号：110736-201842，纯度：96.8%）、甘草苷（批号：111610-201607，纯度：93.1%）、肉桂酸（批号：110786-201604，纯度：98.8%）、桂皮醛（批号：110710-201821，纯度：99.6%）均购于中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈（色谱级，美国DIKMA 公司）；磷酸（色谱级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙醇（分析级，西陇化工股份有限公司）；超纯水（实验室自制）。

DJD 中6 味饮片各收集15 个批次（由哈尔滨中药四厂有限公司提供），产地包含道地药材产地及主产区，见表1。经黑龙江中医药大学吴修红教授鉴定，各饮片均符合2020 年版《中国药典》[10]规定。

表1 15 批DJD 基准样品饮片信息Tab. 1 15 batches of DJD reference samples decoction pieces information

2 方法与结果

2.1 DJD 基准样品的制备

《千金翼方》原文记载DJD 制法为“当归四两，桂心三两，甘草炙二两，芍药六两，生姜三两，大枣十二枚，擘。上六味，咀，以水一斗，煮取三升，分为三服，一日令尽”。根据古籍考证及现代文献[11-12]，1 两折合现代约13.8 g，1 升折合现代200 mL，1 斗为10 升，折合现代2 000 mL，确定DJD 基准样品的制备方法为：取当归55.2 g、白芍82.8 g、大枣55.2 g、生姜41.4 g、桂枝41.4 g 和炙甘草27.6 g，置于锅内加水2 000 mL，浸泡至透心后，调大火煎沸，而后转小火维持微沸状态，直至药液剩余约600 mL，将药液趁热滤过，滤液冻干，得到蜂窝鳞片状粉末，即为DJD 基准样品。将收集到的各批次饮片随机组合，制备成15 批DJD 基准样品，见表2。

表2 15 批DJD 基准样品饮片批号Tab. 2 15 batches of DJD reference samples decoction pieces batch number

2.2 指纹图谱研究

2.2.1 色谱条件 Phenomenex Luna Omega Polar C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），洗脱梯度见表3，流速为1.0 mL/min；波长为220 nm；进样量为10 μL；柱温为35 ℃。

表3 DJD 基准样品指纹图谱洗脱梯度Tab. 3 DJD material reference corresponds to the elution gradient of fingerprint

2.2.2 供试品溶液制备 取DJD 基准样品约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10 mL 甲醇，称重，超声90 min（功率：250 W，频率：40 kHz），放至室温再称重，补足失重，混匀，离心，取上清液，即得。

2.2.3 精密度试验 取DJD 基准样品，按“2.2.2”项下方法制备DJD 供试品溶液，在“2.2.1”色谱条件下进样，连续测定6 次，选择芍药苷作为参照峰，结果各峰的相对保留时间RSD 均小于1%，相对峰面积RSD 均小于3%，表明该仪器的精密度良好。

2.2.4 重复性试验 取DJD基准样品，按照“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2.1”色谱条件下进样，选择芍药苷作为参照峰。结果指纹图谱中的共有峰相对峰面积RSD 值均小于4%，相对保留时间RSD 值均小于3%，说明该方法重复性良好。

2.2.5 稳定性试验 取DJD 基准样品，按“2.2.2”项下方法制备DJD 供试品溶液，分别于制备后0、3、6、9、12、18、24 h 在“2.2.1”色谱条件下进样，选择芍药苷作为参照峰。指纹图谱共有峰在24 h 内的相对保留时间RSD 值小于3%、相对峰面积RSD 值小于3%，表明24 h 内供试品溶液稳定性良好。

2.2.6 指纹图谱的建立 取15 批基准样品，制备供试品溶液，按“2.2.1”项下条件测定。将15 批DJD 基准样品指纹图谱输入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723 版）”，进行多点校正和匹配，得出DJD 基准样品中药指纹图谱的共有模式（R），见图1，明确共有峰并记录峰面积，计算相似度，结果见表4。

表4 15 批DJD 基准样品指纹图谱的相似度评价结果Tab. 4 The similarity evaluation results of the fingerprints of 15 batches of DJD benchmark samples

图1 DJD 基准样品HPLC 指纹图谱共有模式Fig. 1 The common pattern of HPLC fingerprints of DJD samples

2.2.7 主要共有峰的归属及相似度评价 分别制备DJD 基准样品、各个单味药饮片水煎液冻干粉及各个缺味方水煎液冻干粉的供试品溶液，分别采集指纹图谱（见图2、3）。将DJD 基准样品色谱图中各共有峰与饮片、缺味方的色谱峰进行比对，确定各共有峰的来源。结果在DJD 指纹图谱中3、11 和25 号峰源自当归，2、7、8、9、12、16、17、20 和22 号峰源自白芍，4、6、15、16、19、24 和27 号峰源自炙甘草，14 和18 号峰源自桂枝，26 号峰源自生姜，以上色谱峰具有较好的专属性，可作为特征峰；1 号峰由当归、白芍和炙甘草共同产生，5 号峰由桂枝和白芍共同产生，23 号峰由当归和炙甘草共同产生，10 号峰由白芍和大枣共同产生，13、21 号峰由桂枝和炙甘草共同产生，28 号峰为流动相干扰峰。各药味产地随机组合的15 批DJD 基准样品指纹图谱的相似度均大于0.9，表明优质药材制备的基准样品质量稳定、均一。

图2 DJD 基准样品与各单味药样品对照结果Fig. 2 Comparison of sample of DJD and single-flavor medicine sample

图3 DJD 基准样品与阴性样品对照结果Fig. 3 Comparison of sample and negative sample of DJD

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件 （1）阿魏酸 Diamonsil Spursil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.02%磷酸溶液（23 ∶77）为流动相，流速为1 mL/min，等度洗脱；检测波长为324 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。

（2）芍药苷 Diamonsil Spursil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.02%磷酸溶液（14 ∶86）为流动相，流速为1 mL/min，等度洗脱；检测波长为235 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。

（3）甘草苷 Diamonsil Spursil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%磷酸溶液（15 ∶85）为流动相，流速为1 mL/min，等度洗脱；检测波长为276 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。

（4）肉桂酸和桂皮醛 Diamonsil Spursil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.05%磷酸溶液（31 ∶69）为流动相，流速为1 mL/min，等度洗脱；检测波长为280 nm（肉桂酸）、290 nm（桂皮醛）；柱温为30 ℃；进样量为20 μL。

2.3.2 供试品溶液制备 阿魏酸：取DJD 基准样品约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，称重，超声处理（功率：250 W，频率：40 kHz）30 min，放冷至室温，再次称重，补足失重，混匀，离心，取上清液，即得供试品溶液Ⅰ；芍药苷：取DJD 基准样品约0.1 g，精密称定，同供试品溶液Ⅰ方法制得供试品溶液Ⅱ；甘草苷：取DJD 基准样品约0.4 g，精密称定，同供试品溶液Ⅰ方法制得供试品溶液Ⅲ；肉桂酸和桂皮醛：取DJD 基准样品约0.8 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入20 mL75%乙醇，称重，超声处理（功率：250 W，频率：40 kHz）30 min，放冷至室温，再次称重，补足失重，混匀，离心，取上清液，即得供试品溶液Ⅳ。

阴性样品溶液制备：按“2.1”项下DJD 基准样品制备方法，分别制备缺当归、缺白芍、缺炙甘草、缺桂枝的阴性基准样品，并按照供试品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的制备方法分别制备各阴性样品溶液。

2.3.3 对照品溶液制备 取阿魏酸、芍药苷、甘草苷对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每l mL 含阿魏酸45.09 μg、芍药苷298.72 μg、甘草苷77.00 μg 的溶液；取肉桂酸、桂皮醛对照品适量，精密称定，加75%乙醇制成每1 mL 含肉桂酸21.09 μg、桂皮醛17.02 μg 的混合对照品溶液，即得。

2.3.4 专属性试验 精密吸取各指标成分的对照品溶液、供试品溶液及其阴性样品溶液，设置相应的色谱参数，测定并记录色谱图，结果表明阴性对照无干扰，专属性强。

2.3.5 线性关系考察 精密移取各对照品储备液适量，分别按照线性浓度稀释，依次进样，设置相应的色谱参数测定。以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），建立回归方程。结果表明，阿魏酸、芍药苷、甘草苷、肉桂酸和桂皮醛在各自浓度范围内线性关系良好，见表5。

2.3.6 精密度试验 取“2.3.3”项下各对照品溶液，设置相应的色谱参数，同一对照品溶液连续测定5 次，阿魏酸、芍药苷、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛峰面积的RSD 见表5，表明该仪器精密度良好。

2.3.7 重复性试验 取DJD 基准样品，制备“2.3.2”项下供试品溶液6 份，设置相应的色谱参数，分别进样，阿魏酸、芍药苷、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛含量的RSD 见表5，说明该方法重复性良好。

2.3.8 稳定性试验 取DJD 基准样品，按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，于制备后的第0、2、4、6、8、10、12 h 进样，设置相应的色谱参数并进样测定，阿魏酸、芍药苷、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛峰面积的RSD 见表5，表明各供试品溶液12 h内稳定性良好。

2.3.9 加样回收率试验 按“2.3.2”项下方法取已知含量的DJD 基准样品，分别按待测成分含量与对照品加入量1 ∶0.5、1 ∶1、1 ∶1.5 的比例加入对照品，再同“2.3.2”项下方法制得供试品溶液，分别进样，计算加样回收率，结果见表5。

表5 DJD 中指标成分含量测定方法学考察Tab. 5 Methodological study on the determination of index components in reference samples of DJD

2.3.10 样品的含量测定 取15 批DJD 基准样品，制备供试品溶液，测定各成分色谱峰面积，计算阿魏酸、芍药苷、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛的含量，见表6。

表6 15 批DJD 基准样品含量测定结果（%，n = 2）Tab. 6 Content determination results of 15 batches of DJD reference samples （%，n = 2）

3 讨论

3.1 指标成分的选择

本研究前期利用中医方证代谢组学方法从DJD入血的化学成分中选定药效相关成分，再结合成分的生物活性研究报道确定了指标成分。当归为DJD 中的君药，而阿魏酸是当归重要药效成分，其具有镇痛、抗菌、抗氧化、抗炎、抗血栓等作用[13-14]，与DJD主治病症完全吻合；芍药苷是臣药白芍发挥药效的重要成分之一，众多研究表明芍药苷具有镇痛抗炎[15]、保肝[16]、抗心脑血管疾病[17]等生物活性，推测芍药苷是DJD 加减汤治疗慢性低血压的关键成分之一；桂皮醛和肉桂酸作为桂枝的活性成分，桂皮醛在体内迅速转化成肉桂酸[18]，共同发挥抗炎、镇痛、抗肿瘤等疗效[19]；炙甘草中黄酮类活性成分甘草苷具有抗炎、解毒、抗氧化等多种药理活性[20]。DJD 中的药效成分均与其治疗产后腹痛、痛经、胃溃疡等极度相关，各个药味的组方配伍，充分体现了DJD 有效成分的协同作用机制。因此，选择阿魏酸、芍药苷、肉桂酸、桂皮醛、甘草苷作为DJD 指标成分。

3.2 色谱条件的优化

3.2.1 流动相考察 指纹图谱设计中分别对水-乙腈、0.05%磷酸水-乙腈、0.1%磷酸水-乙腈、0.2%磷酸水-乙腈进行考察，结果表明0.1%磷酸水-乙腈作为流动相时出峰较多，分离效果最佳。

各指标成分含量测定参考2020年版《中国药典》，分别考察了0.02%、0.05%、0.1%磷酸水-乙腈，结果肉桂酸和桂皮醛色谱峰在0.05%磷酸水-乙腈作为流动相时分离效果较好，甘草苷色谱峰在0.1%磷酸水-乙腈作为流动相时能获得良好的分离度，而不同浓度的酸均能使芍药苷、阿魏酸色谱峰获得较好的分离，选择最小磷酸浓度组成流动相。

3.2.2 波长的选择 鉴于中药复方的复杂性和整体性，DJD 基准样品HPLC 指纹图谱的检测波长应选择能获得较多指纹峰且各峰强度均适中的波长，故从190 ～ 400 nm 范围内，发现检测波长为220 nm 时能获得的峰最多，峰强度均适中，且包含方中全部药味，故采用220 nm 作为检测波长。

为确定实际含量测定时各组分的检测波长，利用光电二极管阵列检测器测定200 ～ 400 nm 范围内的紫外吸收光谱图，结果显示，阿魏酸、芍药苷、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛分别在324 nm、235 nm、276 nm、280 nm、290 nm 波长处出现最大吸收峰。

3.2.3 柱温考察 本实验考察了DJD 指纹图谱在柱温为25、30、35、40 ℃时的出峰情况，结果表明指纹图谱在35 ℃柱温时各峰能获得较好的分离。各成分的含量测定分别考察了25、30、35 ℃的柱温，并且均在30 ℃柱温时能获得较适宜的保留时间和分离度，因此指纹图谱选定柱温为35 ℃、各指标成分的含量测定柱温选定为30 ℃。

4 结论

本研究建立了DJD 基准样品化学成分指纹图谱分析方法，并开展了效应关联成分的含量测定，建立的方法准确、简便、可靠，是 DJD 基准样品质量控制的有效方法，为经典名方DJD 现代颗粒剂的研究及质量控制提供参考。