中等强度稳态磁场影响小分子结晶的初步探索

张翔飞，周 数，谢 灿，张 磊*

（1. 中国科学院合肥物质科学研究院强磁场科学中心，合肥 230031； 2. 中国科学技术大学科学岛分院，合肥 230036）

水、无机盐、糖类、脂质和蛋白质是构成和维持生物体生命活动所需的基本物质。其中，葡萄糖是自然界中分布最广的一种重要单糖，它是生物体内新陈代谢不可缺少的营养物质，也是生物体生命活动所需能量的主要来源［1］。钙是生物体的必需元素，骨骼、肌肉等组织中富含钙调蛋白，神经传递、激素释放等功能需要钙的参与，缺乏钙元素易得骨质疏松、佝偻病以及骨发育不全等疾病［2］。氯化钠同样也是人体必不可缺的物质，在维持细胞内外液渗透压，调节体内酸碱平衡以及维持神经与肌肉的兴奋等多种功能上都有作用［3-4］。

相分离在生物功能行使中起着重要作用，P颗粒（P granules）具有类似液体的特性就是相分离的一个例子［5］。相分离可以实现细胞内部功能区域的划分，协助细胞进行生理活动［6］。越来越多的证据表明，相分离过程有可能是这种混乱和秩序的联结者［7-8］。结晶是分子有序排列和堆积的过程，而许多分子在特定参数的磁场下可能受到磁场力的作用而出现有序排列［9］。研究磁场对结晶过程的影响有助于揭示磁场对分子有序性的作用规律以及磁生物学效应的机理。

磁场影响溶液结晶的过程已有部分研究，磁场处理可以对晶体的结晶热力学和动力学产生影响，尤其是在一定的磁场条件下能显著地影响晶核形成和晶体生长速度［10-13］。虽然很多文献都报道了磁场可以改善晶体的结晶过程，但由于结晶过程复杂，影响因素众多，如结晶物本身的结构、溶剂的选择、温度、饱和度、不同的结晶方式等均会对结晶与否以及结晶过程产生重要的影响。磁场作为一种可能改变分子有序性的物理场，不同参数的磁场是否能影响不同物质的结晶过程尚未可知。本文对外加磁场作用下的葡萄糖和葡萄糖酸钙的冷却结晶和氯化钠的蒸发结晶过程进行初步探究，揭示了不同磁场对不同物质的结晶过程影响不同，同时也对不同磁场对水分蒸发量的影响做了初步探索。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

葡萄糖（G5767）和一水合葡萄糖酸钙（G4625）购于Sigma-Aldrich公司，氯化钠（1.06404）购于Supelco公司，去离子水由Thinklab超纯水系统产出。

1.2 主要仪器

上海一恒三孔三温水浴锅、低温恒温培养箱［MIR-254（-PC），Panasonic］、Olympus-SZX10光学显微镜以及ME204E分析天平。

1.3 试验设置

静磁场作用于结晶过程的试验设置由加磁/对照装置和结晶装置两部分组成，具体如图1中a～c所示。试验装置按照加磁条件设置为对照组、磁场1组（magnetic field 1，MF1）和磁场2组（magnetic field 2，MF2）。对照组装置使用长×宽×高为100 mm×100 mm×10 mm左右的铝板，加磁装置分别使用长×宽×高为100 mm×100 mm×10 mm左右的钕铁硼磁板和长×宽×高为100 mm×100 mm×20 mm左右的钕铁硼磁板作为静磁场源。磁场1组施加在液滴高度（距磁体表面约3 mm）的平均磁感应强度约为0.036 T，与此相对应，磁场2组的平均磁感应强度约为0.068 T。结晶部分用底部长×宽为103 mm×103 mm的4×4的16孔结晶培养板（天津翔宇顺高分子材料有限公司）。冷却结晶时将圆形硅化盖玻片（直径22 mm，BioJane公司）扣在边缘涂了真空脂（七聚二甲基硅油分子内聚二氧化硅，DOW CORNING®公司）的结晶孔上以达到密封的效果；蒸发结晶时则为开放式自然蒸发，不密封。结晶培养板底部可以稳定地恰好卡住铝板和磁板，保证液滴受到的磁场作用恒定。整个结晶过程的试验都在16℃的晶体恒温培养箱中进行。

图1 静磁场作用于结晶过程的试验设置示意图和磁场对葡萄糖冷却结晶的影响Fig. 1 Schematic diagram of the experimental setup of static magnetic field acting on the crystallization process and the effect of magnetic field on the cooling crystallization of glucose

1.4 晶体的培养和测试

1.4.1 待结晶溶液的配置

根据各物质的溶解度曲线和结晶方法［14-16］，结合前期试验结果，选取合适的质量浓度、水浴温度和时间进行试验。基本流程为用分析天平称取所需药品，加入去离子水，选取不同水浴温度和时间，将药品彻底溶解至澄清透明，用于后续的结晶试验。本试验使用的葡萄糖的配置质量浓度为2.80 g/mL（溶质/溶剂），水浴温度为70℃，水浴时间为12 h；葡萄糖酸钙的配置质量浓度为0.115 2 g/mL，水浴温度为65℃，水浴时间为6 h；氯化钠的配置质量浓度为0.10 g/mL和0.28 g/mL，水浴温度为室温，水浴时间为1 h。值得注意的是，进行下一步试验之前需将溶液再次摇晃混匀。

1.4.2 结晶试验和观测

结晶试验统一采用50 μL体系进行晶体培养。具体来说，将配置好的待结晶溶液用微量移液器取50 μL缓慢滴入结晶板上的结晶孔中心进行晶体培养和观察。其中，冷却结晶试验，如葡萄糖和葡萄糖酸钙的结晶，采用圆形硅化盖玻片和真空脂对结晶孔进行密封；蒸发结晶试验则无需密封。

分装完毕后的晶体培养板分别放置在无外加磁场或不同磁场强度的试验装置上进行晶体的培养。在不同的时间分别记录晶体的生长状况，根据产生晶体的实际情况，如单晶或者晶簇，分别记录晶体板中所有结晶孔中晶体析出的比例，或者对每个结晶孔中的晶体或晶簇进行计数或称重。图片由FLUOCAD和FCSnap软件拍摄并进行定性定量分析统计，其他试验数据用GraphPad Prism 9处理分析并作图。

1.5 磁场影响溶液蒸发量的试验

每次试验包括3组试验同时进行，3组分别为无外加磁场组、磁场1组和磁场2组。每组试验包括3种溶液，500 μL去离子水、500 μL不同质量浓度（0.10 g/mL和0.28 g/mL）的氯化钠溶液，分别加入18 mm培养皿中，用分析天平称重并记录为0 h质量。将上述3种溶液置于无外加磁场和2种不同磁场中进行自然蒸发试验，环境湿度为88%，每隔1.5 h称其质量并记录，直到6 h结束。后一时间点与前一时间点的质量差即为该种溶液在这一时间段内的蒸发量。

1.6 统计学分析

所有试验均重复至少3～4次。定量分析数据显示为平均值±标准误（±sχ），并利用Graphpad软件进行t检验计算P值，结果表示为：*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.005和****代表P＜0.001。

2 结果与分析

2.1 磁场对葡萄糖冷却结晶过程的影响

试验发现，中等强度稳态磁场对葡萄糖的冷却结晶有明显促进作用，表现在晶体析出的比例和质量等多方面，但不同参数的磁场处理会有差异（图1）。其中，磁场1对葡萄糖的冷却结晶促进效果相对更明显。图1d显示，经过1 h磁场处理后，葡萄糖晶簇的析出孔数比例明显高于对照组，2种磁场下的晶簇析出比例分别为对照组的2.42倍（磁场1）和2.15倍（磁场2）。同时，在磁场下葡萄糖单孔析出的晶体质量也明显高于对照组（图1e），分别约为对照组的1.94倍（磁场1）和1.46倍（磁场2）。利用显微镜成像对3种结晶条件下的晶体析出情况进行对比和分析，图1f为3种结晶条件下的典型照片，结果表明，与对照组相比，磁场下的晶体析出明显更密集更多。

2.2 磁场对葡萄糖酸钙冷却结晶过程的影响

磁场同样也影响了葡萄糖酸钙的冷却结晶过程。首先，选取一系列质量浓度的葡萄糖酸钙溶液进行冷却结晶的尝试（图2a），发现经过36 h后，质量浓度为0.115 2 g/mL的葡萄糖酸钙溶液晶簇的析出比例最高，且在多次试验中重复性较好，因此，选择这一质量浓度进行后续磁场结晶试验。

在磁场下12 h后，如图2b所示，仅有磁场1的条件下观察到了晶簇的析出，析出孔数的比例约为90%，而对照组和磁场2均无晶簇明显析出。图2c所示的单孔晶体质量与晶簇析出比例类似。在磁场下处理24 h后，如图2d所示，对照组、磁场1组和磁场2组的晶体析出比例约为81%、100%和90%，磁场1组和磁场2组分别约为对照组的1.23倍和1.11倍，加磁两组单孔晶体的质量比对照组高约78%和43%（图2e）。

图2 磁场对葡萄糖酸钙冷却结晶的影响Fig. 2 Effect of magnetic field on cooling crystallization of calcium gluconate

2.3 磁场对氯化钠蒸发结晶过程的影响

因为氯化钠的溶解度随温度变化较小，根据以往文献报道［17］和前期试验，我们决定采用自然蒸发法对氯化钠溶液进行结晶，因此，首先需要了解磁场是否会对氯化钠溶液的蒸发过程产生影响。由图3可知，在12 h的蒸发过程中，与对照组无外加磁场相比，磁场1对去离子水和2种不同质量浓度（0.10 g/mL和0.28 g/mL）的氯化钠溶液的水分蒸发均显示出很强的促进作用，磁场下的蒸发量分别约为无外加磁场对照组的1.17倍、1.17倍和1.15倍，但磁场2的效果则相对较为微弱。试验中低质量浓度蒸发速度比高质量浓度蒸发速率快的现象也符合“拉乌尔定律”。

图3 磁场对氯化钠溶液蒸发量的影响Fig. 3 Effect of magnetic field on the evaporation of sodium chloride solution

随后，对磁场是否影响氯化钠蒸发结晶过程进行了研究，选择了0.10 g/mL和0.28 g/mL两种不同的氯化钠溶液。如图4所示：加磁处理6 h和12 h后，无论是低质量浓度还是高质量浓度的氯化钠溶液的单孔晶体析出数量都无显著性差异；但在磁场下析出的晶体体积普遍比无外加磁场析出的相对要大，导致了单孔析出晶体的质量增加。如图4c、4f所示：在加磁场处理12 h后，低质量浓度氯化钠加磁组析出晶体质量远高于对照组，磁场1和磁场2中单孔晶体析出质量分别约为对照组的4.58倍和3.11倍；高质量浓度氯化钠加磁组的效果稍弱，分别为无外加磁场对照组的1.19倍和1.47倍。

图4 磁场对氯化钠蒸发结晶的影响Fig. 4 Effects of magnetic field on evaporative crystallization of sodium chloride

3 讨论

磁场影响葡萄糖和葡萄糖酸钙结晶主要体现在单孔析出的晶体比例和晶体析出质量等方面。单孔析出的晶体比例与晶核的形成率相关，而晶体析出的质量一定程度上取决于晶体生长的过程。一般来说，晶核的形成率由晶核的“临界尺寸”、“表面能”和“过冷度”等因素共同决定［18-20］。磁场可能会在一定程度上提高溶液中葡萄糖和葡萄糖酸钙的有序性，从而增加其晶核的形成效率。同时，据文献报道，磁场还可能影响溶液的黏度和涡流，从而影响结晶速度［19］，这可能是在磁场下葡萄糖和葡萄糖酸钙晶体析出的数量和质量均增加的原因之一。需要指出的是，结晶过程是一个非常复杂的过程，磁场并不是单一的影响因素或者主要影响因素，且不同的磁场参数对结晶过程的影响也有差异。

磁场影响氯化钠蒸发结晶的其中一个重要因素是蒸发量。据已有文献报道，磁场处理导致溶液表面张力减小，从而使得气泡核化势垒降低，其临界半径也减小，促进了更小的气泡的汽化，从而提高了溶液的蒸发速率［10，21］。但从我们的试验来看，不同参数的磁场对溶液蒸发量的影响是不同的，这充分说明了其机理的复杂性。

根据磁场对氯化钠蒸发结晶影响的试验，从晶体析出质量来看，磁场对低质量浓度和高质量浓度氯化钠溶液的蒸发结晶都有促进作用，但对低质量浓度氯化钠溶液的效果更强。这一结果和图3所示是一致的。如前所述，磁场1加速了溶液的蒸发，使得溶液更早地到达过饱和状态并析出晶体，而磁场2仅对高质量浓度溶液的蒸发有加速作用，从而促进晶体的析出。同时，磁场处理还将导致溶液涡流增强和黏度降低，这种磁场效应对低质量浓度溶液作用更为明显。因此，对于氯化钠溶液的蒸发结晶来说，在低质量浓度下磁场1组受到磁场和蒸发的双重作用，从而析出结晶效果更强；而在高质量浓度下，磁场2组的结晶效果更强。

综上所述，本研究以葡萄糖、葡萄糖酸钙和氯化钠3种物质为例，使用2种不同磁感应强度的中等稳态磁场（静磁场），研究了磁场对溶液的冷却结晶和蒸发结晶过程的影响。研究结果表明，磁场对以上3种物质的结晶均有促进作用，但不同参数的磁场对不同物质的结晶过程影响程度不同。磁场对结晶过程的影响为我们进一步研究磁场对生物相分离的影响，以及磁生物学效应的机制提供了新的视野。此外，静磁场具有高效、节能、环保的优点，因此，利用静磁场提高结晶的效率和产量，对于制药和工业生产也具有现实意义，在深入研究后于未来有望被广泛应用于制药和各种工业结晶工艺中。