肾癌中COL1A1的表达对临床预后的价值及其与免疫浸润的相关性分析

李 媛 孙景芬 张 玲 王 扬 李 妍

肾癌是泌尿系统常见的肿瘤之一，近二十年来其发病率呈上升趋势，占所有新发肿瘤病例的2%～3%。肾细胞癌是最常见的肾癌，大约包括85%的肾癌病例[1-2]。尽管肾细胞癌在诊断、筛查、手术和药物治疗方面取得了一定进展，但其临床结果仍令人不满意[3]。因此，寻找有效的生物标记物，特别是目前的免疫疗法，将有助于提高肾细胞癌的临床治疗效果。

COL1A1是胶原蛋白家族成员之一，参与I型胶原蛋白的编码，主要调节细胞间的黏附和分化[4]。在成骨、骨质疏松及骨疾病中发挥一定作用。研究发现，COL1A1在多种肿瘤中呈高表达状态，包括乳腺癌和胃癌等[5]，然而，COL1A1在肾癌中的研究还不是很清楚。本研究通过在线数据库挖掘COL1A1在肾癌中的表达，并评估其对肾癌患者预后的生存价值。

材料及方法

1.肾透明细胞癌患者临床数据的收集

UALCAN(http：//ualcan.path.uab.edu/)[6]数据库应用于癌症转录组数据的分析，提供基于基因表达和已发布的生存信息的描述。本实验利用UALCAN数据获得泛癌中COL1A1的表达水平。通过在线TCGA数据库(https：//portal.gdc.cancer.gov/)[7]获取肾透明细胞癌患者基因表达及生存预后的数据。所有明确诊断为肾透明细胞癌的患者均被纳入统计分析，肾透明细胞癌患者癌组织标本539例，癌旁组织标本72例。

2.COL1A1与免疫浸润的关系

从TIMER2.0数据库获得肾透明细胞癌中COL1A1的表达与免疫细胞浸润的关系数据。TIMER2.0是分析不同类型癌症免疫浸润的综合数据库(https：//cistrome.shinyapps.io/timer/)[8-9]。从基因表达谱推断肿瘤浸润免疫细胞(TIICs)的峰度值。TIMER数据库包括来自癌症基因组图谱(TCGA)的32种癌症类型的10897个样本，以估计免疫浸润的峰度。我们利用基因模块分析了COL1A1在KIRC中的表达，并分析了COL1A1表达与免疫浸润(包括B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞及NK细胞)峰度的关系。抗肿瘤纯度的基因表达水平借鉴已有文献[10-11]。

3.统计学分析

在R语言安装ggplot2包的条件下，分析COL1A1在肾透明细胞癌患者中的表达情况，survival包用于生存资料的统计分析[7]。log-rank检验[12]分析各组的生存时间分布差异；卡方检验分析COL1A1与肾透明细胞癌患者临床病理分组的关系。P<0.05视为结果具有统计学差异。

结 果

1.COL1A1在泛癌中的表达情况

从TCGA数据库中获得COL1A1在泛癌中的表达水平，结果显示COL1A1在乳腺癌、胆管癌、胃癌、肺腺癌及肾癌等患者中高表达，在宫颈癌、胸腺瘤及子宫内膜癌中呈低表达状态(图1)。

2.COL1A1在肾透明细胞癌中的表达情况

为了探讨COL1A1在肾透明细胞癌中的作用，利用TCGA数据库获得COL1A1在肾透明细胞癌中的表达情况，结果显示，COL1A1在肾透明细胞癌中呈高表达状态，相比健康对照组，差异具有统计学意义(P<0.001，图2)。

图1 COL1A1在泛癌中的表达

图2 COL1A1在肾透明细胞癌中的表达

3.肾透明细胞癌患者COL1A1的表达对生存预后的影响

为探讨肾透明细胞癌患者COL1A1的表达水平与生存预后的关系，本实验选取了20年生存期的数据进行分析。结果显示，高表达COL1A1肾透明细胞癌患者相比低表达COL1A1患者具有更好的临床预后，即COL1A1的表达与肾透明细胞癌患者20年的预后生存率相关(P=0.001，图3)。

图3 COL1A1的表达水平与总生存期的相关性

log-rank的检验结果显示，肾透明细胞癌患者的生存时间分布和正常对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.001，表1)。

表1 生存时间分布统计表

对于预后的单因素Cox回归分析结果显示，COL1A1对肾透明细胞癌的预后诊断具有一定的预测价值(表2)。

表2 单因素Cox回归分析结果

4.COL1A1表达与临床病理分组的相关性

从数据库中获得的临床病理数据，其中高表达COL1A1患者270例，低表达COL1A1患者269例。数据统计结果显示，COL1A1的表达水平与肾透明细胞癌的T分期、N分期及年龄存在一定的相关性(P<0.05)，与肾透明细胞癌的M分期无明显相关性(P>0.05，表3)。

表3 COL1A1的表达与临床病理参数的相关性

5.COL1A1对肾透明细胞癌的诊断价值

ROC曲线结果显示，1年生存期AUC=0.631，2年生存期AUC=0.589，3年生存期AUC=0.570，表明COL1A1对肾透明细胞癌的诊断具有一定的临床价值(图4)。

图4 COL1A1的ROC曲线

6.肾透明细胞癌患者COL1A1的表达与免疫浸润的关系

肿瘤浸润免疫细胞作为肿瘤微环境的重要组成部分，与肿瘤的发生、进展及转移密切相关。抗肿癌纯度的基因表达水平如图5所示。肾透明细胞癌中COL1A1与CD4细胞、DC细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞及中性粒细胞表达呈正相关(P<0.05)，与B细胞表达呈负相关(P<0.05)，与CD8表达无明显相关性(P>0.05)(图5)。

图5 COL1A1的表达与免疫浸润的关系

讨 论

哺乳动物细胞中，Ⅰ型胶原蛋白含量丰富，是由2条COL1A1基因编码的α1链和1条COL1A2基因编码的α2链组成的三螺旋结构。I型胶原纤维主要参与形成细胞外基质，对细胞的粘附及分化有重要作用，由于肿瘤细胞间的粘附作用普遍降低，因此促进了肿瘤细胞的迁移[13]。研究发现，COL1A1参与了谷氨酰胺介导的胰腺癌与星状细胞的相互作用[14]。沉默COL1A1的表达可以抑制小鼠结直肠肿瘤的原位生长[15]。另外，细胞学实验发现，干扰COL1A1的表达抑制了肝癌的克隆、侵袭及转移[16]。这些研究表明，COL1A1在多种肿瘤的形成及代谢中发挥重要作用。然而，COL1A1在肾癌中的研究甚少。

本研究通过TCGA数据库获得的数据分析结果显示，在mRNA水平上，与癌旁组织相比，COL1A1在肾透明细胞癌中呈明显高表达状态(P<0.05)，其表达水平与其预后呈负相关(P<0.05)。Cox回归分析和ROC曲线结果提示，COL1A1对肾透明细胞癌的预后诊断具有预测价值。COL1A1的表达水平与肾透明细胞癌的T分期、N分期及年龄存在一定的相关性。表明COL1A1对肾透明细胞癌的临床诊断及预后评估具有一定的临床价值，是否能作为诊断标志物还有待进一步分析。

免疫反应与临床预后密切相关，肿瘤浸润免疫细胞(TIIC)形成一个生态系统，肿瘤微环境对肿瘤的进展有调节作用，TIIC对于肿瘤的预后研究具有一定的价值。细胞毒性CD8+T细胞和CD4+辅助T细胞可以靶向肿瘤抗原细胞抑制肿瘤生长。CD4+T细胞浸润后可以通过TGFβ1/YBX1/HIF2α信号调节多种肿瘤细胞的增殖[17]。肿瘤浸润淋巴细胞是肿瘤淋巴结状态和生存的独立预测因子[18]。微环境基质中的癌相关成纤维细胞参与了多种肿瘤浸润免疫细胞的功能。本研究应用TIMER2.0评估了肾透明细胞癌中COL1A1表达与免疫浸润水平之间的关系。通过分析发现，COL1A1表达与肿瘤纯度呈显著负相关，与CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、DC细胞、单核细胞及中性粒细胞浸润水平呈显著正相关，与B细胞浸润水平呈负相关，但与CD8+T细胞浸润水平无显著相关性。

因此，本研究得出结论，低表达COL1A1的肾透明细胞癌患者具有较好的临床预后。COL1A1的表达与免疫细胞浸润水平有关。这一结果为寻找肾透明细胞癌的诊断标志物、治疗靶点及预后评估的指标确定提供一定的理论依据。