吡咯喹啉醌对长波紫外线诱导的HaCaT 细胞急性光损伤的作用*

谷丽，施智男，周 舒，赵静婷，翟小玉，顾丽群，花卉*

(南通大学附属南通第三医院皮肤性病科，南通 226006)

皮肤是抵御人体外部环境的物理、化学或生物等各种刺激的第一道防线。皮肤过度暴露于紫外线(ultraviolet,UV)会导致各种皮肤疾病，如晒伤、红斑、过早老化、炎症和氧化损伤[1-2]。人类紫外线暴露的主要来源是太阳光，根据其波长可分为UVC(100～290 nm)、UVB(290～320 nm)和UVA(320～400 nm)[3]。到达地球表面的紫外线是由95%的UVA 和5%的UVB 组成，UVA 具有更强的穿透性，可达皮下组织，影响真皮和表皮的皮肤结构[4]。皮肤过度暴露UVA辐射后，会产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)，引起细胞氧化应激，造成细胞蛋白质、脂质、核酸和膜以及细胞器的损伤，引发多种细胞反应，包括凋亡和炎症[5-6]。现阶段人们对生活品质的追求越来越高，因此探寻一种安全、有效的新型光防护剂，已成为皮肤科研究领域的热点之一。

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinine,PQQ)是一种不依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸的葡萄糖脱氢酶辅基，具有极强抗氧化还原功效，现已被认为是一种重要的营养生长因子，在调节细胞能量代谢过程中发挥重要的作用[7]。研究[8]表明PQQ 具有多种生理功能，包括保护神经和心血管，促进生长和增殖，并作为一种抗氧化剂保护细胞免受氧化应激引起的损伤。然而，关于PQQ 对UVA引起的皮肤急性光损伤的影响鲜见报道。本研究以HaCaT 细胞为研究对象，探讨PQQ 对UVA 诱导HaCaT 细胞急性光损伤的保护作用及潜在机制，为新型抗皮肤光损伤产品开发提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器 HaCaT 细胞购于上海中乔新舟生物科技有限公司；PQQ 购于上海源叶生物科技有限公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；DMEM 培养液购于美国Gibco 公司；细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)、Annexin-V-FITC 凋亡检测试剂盒、RIPA 缓冲液、BCA 试剂盒、胰蛋白酶、青霉素-链霉素溶液购于上海碧云天生物公司；B 淋巴细胞瘤-2 基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、β-actin 抗体购于上海碧云天生物公司，Bcl-2-associated X 的蛋白质(Bcl-2-associated X,Bax)抗体购于美国Abcam公司；UVA 辐射灯、紫外线辐射强度仪购于上海希格玛高技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HaCaT 细胞培养 复苏HaCaT 细胞，接种于含10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素溶液的DMEM 培养基，在37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞生长至近融合状态，采用0.25%胰酶消化，按1∶3 传代至培养皿中。

1.2.2 CCK-8 法测定细胞增殖活性 将细胞接种于96 孔板内，待细胞生长至50%，每孔加入不同浓度(50、100、150、200、250 nmol/mL)的PQQ，每个浓度设3 个复孔，对照组加入相同体积的培养基，继续培养24 h。每孔加入10 μL CCK-8 溶液，培养箱内继续孵育24 h，在450 nm 吸光度下用酶标仪检测光密度(optical density,OD)值。

1.2.3 UVA 辐射 待细胞密度达80%～90%后，从细胞培养箱中取出，用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)替换细胞培养基，用UVA 辐射强度仪标定UVA 照射仪的照射度，UVA 剂量=UVA照射度×时间(s)，光照剂量为UVA 10 J/cm2，培养皿距灯管距离10 cm，一次性连续照射，照射结束后，各组细胞换新鲜培养基，37 ℃、5%CO2下培养24 h。

1.2.4 实验分组 将HaCaT 细胞接种于细胞培养板，分为4 组：对照组、PQQ 组、UVA 组、UVA+PQQ组。对照组为正常生长的HaCaT 细胞，未予其他处理；PQQ 组用150 nmol/mL PQQ 培养24 h；UVA 组细胞予UVA 10 J/cm2照光；UVA+PQQ 组先予PQQ预处理后培养24 h，然后使用10 J/cm2剂量的UVA照射。

1.2.5 倒置显微镜观察细胞形态 将细胞接种于6孔板里，待细胞生长至80%，按要求分别处理各组细胞，完全培养基继续培养24 h，倒置显微镜下观察细胞的形态变化。

1.2.6 细胞内ROS 的测定 各组细胞予UVA 辐射后，完全培养基继续培养24 h，去除细胞培养液，使用无血清培养液1∶1 000 稀释2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐 (2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)，每孔加入1 mL 盖住细胞。37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。用无血清细胞培养液洗涤细胞3 次，流式细胞仪检测细胞内ROS 水平。

1.2.7 细胞凋亡率检测 各组细胞予UVA 辐射后，完全培养基继续培养24 h，用PBS 冲洗2 次，使用胰酶消化，将细胞悬液放入离心机中1 500 r/min 离心5 min，弃上清，加入195 μL Annexin Ⅴ-FITC 结合液轻轻重悬细胞。加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL 碘化丙啶染色液，轻轻混匀，转入流式管中，室温(20～25 ℃)避光孵育10～20 min，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.2.8 Western Blot 检测 各组细胞予UVA 辐射后，完全培养基继续培养24 h，用PBS 冲洗2 次，使用RIPA 裂解缓冲液裂解细胞，提取各组细胞总蛋白，用BCA 蛋白测定试剂盒(Beyotime)检测蛋白质浓度。制胶、上样、电泳、转膜，室温下，用5%脱脂牛奶在PBS 中封闭膜1 h，加Bcl-2、Bax 一抗(均1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜2 次，30 min/次，加二抗(1∶1 000)，室温下孵育3 h 后用TBST 洗膜，最后采用Tanon 5200 全自动化学发光/荧光图像分析系统检测蛋白条带表达情况。

1.2.9 统计学方法 所有实验至少重复3 次。使用GraphPad Prism(GraphPad Software,SanDiego,CA)软件进行分析，检测数据均以表示，应用单因素方差分析进行组间比较，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度PQQ 对HaCaT 细胞增殖率的影响CCK-8 结果显示，50、100、150 nmol/mL PQQ 对Ha-CaT 细胞的增殖活性无明显影响(均P＞0.05)，浓度为200、250 nmol/mL 时，PQQ 可显著抑制HaCaT 细胞的增殖活性(均P＜0.01)(图1)。因此，选择150 nmol/mL PQQ 用于后续实验。

图1 不同浓度PQQ 对HaCaT 细胞增殖活性的影响

2.2 PQQ 对UVA 照射HaCaT 细胞形态学的影响正常的HaCaT 细胞生长状态良好，密集分布；UVA照射后，HaCaT 细胞出现皱缩、体积变小，细胞间隙增大，细胞碎片增多，死亡细胞增加；PQQ 预处理后再予UVA 照射，细胞密度增加，细胞间隙减小，且细胞形态改善；PQQ 处理后对正常HaCaT 细胞的形态无影响(图2)。

图2 PQQ 对UVA 照射HaCaT 细胞形态学的影响(200×)

2.3 PQQ 对UVA 照射HaCaT 细胞ROS 水平的影响 与对照组相比，UVA 组的ROS 水平明显升高(P＜0.05)，PQQ 组ROS 水平差异无统计学意义(P＞0.05)；与UVA 组相比，UVA+PQQ 组的ROS 水平明显下降(P＜0.05)；结果表明PQQ 可以显著降低UVA诱导的ROS 生成(图3)。

图3 PQQ 对UVA 照射HaCaT 细胞ROS 水平的影响

2.4 PQQ 对UVA 照射HaCaT 细胞凋亡率的影响与对照组相比，UVA 组细胞的凋亡率明显增加(P＜0.05)，PQQ 组凋亡率差异无统计学意义(P＞0.05)；与UVA 组相比，UVA+PQQ 组细胞凋亡率明显下降(P＜0.05)(图4)。

图4 PQQ 对UVA 照射HaCaT 细胞凋亡率的影响

2.5 PQQ 对UVA 照射后HaCaT 细胞凋亡相关蛋白的影响 与对照组相比，UVA 组Bcl-2 的表达显著降低，Bax 表达显著增加(P＜0.05)；与UVA 组比较，UVA+PQQ 组Bcl-2 的表达显著增加，Bax 的表达显著降低(P＜0.05)(图5)。

图5 PQQ 对UVA 辐射后HaCaT 细胞凋亡相关蛋白的影响

3 讨论

大量研究[9]证实UVA 辐射诱导的ROS 在皮肤细胞中发挥重要作用，并导致皮肤氧化应激损伤。因此，通过补充抗氧化剂来提高皮肤细胞的抗氧化能力，可能是预防UVA 导致皮肤光损伤的一个有价值的策略。PQQ 被定义为一种新型的维生素B，广泛存在于各种食物(蔬菜、水果、牛奶等)中，已被证实具有抗氧化作用[10]。研究[11]发现，PQQ 对高糖诱导的体外糖尿病肾病模型氧化应激损伤和细胞凋亡具有保护作用，其保护作用与抑制ROS 的产生和提高抗氧化剂超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的水平有关。PQQ可通过减轻软骨细胞的氧化损伤、DNA 损伤和细胞衰老改善骨关节炎的症状[12]。本研究发现在体外建立的UVA 诱导的光损伤模型中，PQQ 可以保护Ha-CaT 细胞免受氧化应激损伤，主要表现为明显降低细胞ROS 含量，减少细胞凋亡的发生，增加抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达及降低促凋亡蛋白Bax 的表达。

UVA 照射可以造成被辐射细胞发生不同程度的光损伤[13]。本研究发现，UVA 照射可引起HaCaT 细胞受损，出现皱缩、变圆，细胞活力降低。通过PQQ预处理后，发现PQQ 可明显改善细胞形态，提高细胞活力，表明PQQ 可以保护细胞免受光损伤。UVA照射引起的ROS 过度释放会对细胞造成不可逆转的损伤，并导致皮肤癌、皱纹和光老化，因此控制ROS的水平是防御UVA 光损伤的重要环节[14]。研究[15]证明黄芪多糖处理后HaCaT 细胞活力显著增加，ROS产生受到抑制，同时改善线粒体功能障碍，对UVA诱导的细胞光损伤具有保护作用。本研究采用流式细胞仪检测细胞内ROS 水平发现，10 J/cm2UVA 辐射可导致HaCaT 细胞产生ROS 增多，而加入PQQ预处理可明显抑制ROS 产生。这些结果提示，PQQ通过清除UVA 照射产生的过量ROS，提高了细胞活力，从而保护HaCaT 细胞免受UVA 诱导的光损伤。

ROS 的稳态是维持细胞正常生理的一个主要因素，ROS 的失衡可能促进线粒体功能障碍并触发线粒体介导的凋亡，导致细胞程序性死亡[16]。本研究结果显示，暴露于10 J/cm2UVA 后，HaCaT 细胞的凋亡程度显著增加，而PQQ 处理显著减少了细胞凋亡，证明PQQ 预处理可改善细胞凋亡情况，具有抗凋亡的作用。UVA 诱导的细胞凋亡是一个复杂的过程，涉及外在途径和内在途径，内在途径主要是受Bcl-2 家族蛋白和p53 肿瘤抑制蛋白调控[14]。UVA诱导的细胞凋亡主要是通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达，而UVB 诱导的细胞凋亡与p53 的积累有关[17]。S.WU等[18]发现矢车菊素-3-O-葡萄糖苷预处理能增加抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax 的比值，从而降低UVA 辐射引起的成纤维细胞的凋亡。与本研究PQQ 预处理可通过上调Bcl-2 表达，并下调Bax的表达，进而达到抑制UVA 辐射导致的凋亡率增加的结果一致。

综上所述，本研究初步证实了PQQ 可通过降低ROS 水平，减少细胞凋亡率；同时通过上调Bcl-2、下调Bax 的表达起到抗凋亡作用，进而保护HaCaT细胞免于UVA 导致的氧化应激损伤，为治疗皮肤光损伤奠定了基础，但其具体作用机制和靶点有待进一步深入研究。