结直肠癌根治术患者Nrf2、HO-1因子变化及在预后判断中的应用

徐 伟，望小杰，吴 磊

上海市宝山区罗店医院普外科，上海 201908

随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，结直肠癌发病率日益升高，已在我国居民消化道恶性肿瘤中位列第三，其发生、发展是一个多因素和多步骤的复杂过程，而且伴有淋巴结转移的患者预后较差，远期生存率并不理想[1-2]。因此，了解结直肠癌发生、发展、侵袭、转移的规律，并对此类患者复发及死亡风险进行准确鉴别及分层，对寻找特异性分子靶点及靶向药物，优化临床结局十分重要[3]。近年来研究表明，转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)及其信号通路参与了肿瘤的形成与发展，同时其结合核酸序列上含有一段抗氧化反应元件(ARE)信序列，可激活基因或其他转录因子的表达，对于癌细胞的增殖、侵袭及转移均具有重要作用，是当下研究热点之一[4-5]。但是，现阶段对Nrf2、血红素加氧酶-1(HO-1)在结直肠癌预后预测中的价值尚不明确，这两种因子是否也有类似的特性尚缺乏可靠的依据。基于此，本研究以本院接受腹腔镜根治术治疗的84例结直肠癌患者为观察对象，并利用免疫组织化学染色检测组织中Nrf2、HO-1的表达情况，并收集其与临床特征及预后相关的数据，旨在探讨其可能存在的潜在临床意义，为临床实践提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年3月至2020年1月于上海市宝山区罗店医院接受结直肠癌根治术治疗的结直肠癌患者86例为研究对象，所有患者年龄在49～76岁，平均(67.13±6.95)岁，术后进行规范的辅助化疗。纳入标准：(1)术前1个月无手术、放疗、化疗等治疗史；(2)均接受由同一组医护人员实施的规范性结直肠癌根治术[6]，且术后经病理学检测确诊为结直肠癌；(3)进行长期规律的门诊复诊和电话随访；(4)保留有完整癌组织及距癌组织边缘>5 cm的正常组织蜡块标本；(5)入组前3个月未服用过非甾体类抗炎药、皮质激素药物。排除标准：(1)孕产妇或有肺、胃等其他肿瘤的特殊人群；(2)5年内有其他恶性肿瘤既往史者；(3)手术前后缺失血常规、术后病理缺失TNM分期等关键数据者；(4)免疫组织化学染色效果不理想者；(5)术前已转移、接受姑息性切除的患者；(6)危重症患者(Kamofsky生存质量评分小于60分)。

1.2方法

1.2.1组织切片制作和免疫组织化学染色 所有患者均选取3个典型的癌组织和2个相邻癌旁正常组织(距癌组织边缘>5 cm)，经10%甲醛固定后制成4 μm厚石蜡切片，参照免疫组织化学染色按试剂盒说明书进行操作。切片脱蜡与水化之后，于室温下进行孵育、漂洗、甩干等操作，二氨基联苯胺法显色，并采用苏木素复染细胞核，时间约2 min，盐酸酒精分化，流水冲洗返蓝，用梯度浓度的乙醇依次冲洗5 min，入流水2 min，二甲苯透明，中性树胶封片。采用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，将已得出结果的结直肠癌组织中Nrf2、HO-1高表达组织切片作为阳性对照。严格依据免疫组织化学染色试剂盒(购自英国Abcam公司)说明书标准检测。

1.2.2免疫组织化学染色结果判定 由两位有经验的病理医师分别双盲阅片，于400倍显微镜(奥林巴斯CX23)下观察，NIS-Elements Br3.0分析软件计算吸光度值，并根据文献[7]中的相关标准进行结果判定。Nrf2、HO-1主要定位于细胞质内，阳性结果为细胞出现棕黄色至深褐色，根据染色强度和染色面积百分比量化蛋白相对表达水平。(1)染色面积百分比评分：阳性细胞百分比<6%、6%～<26%、26%～<51%、51%～<76%、≥76%分别判定为0、1、2、3、4分。(2)显色评分：染色强度以无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别判定为0、1、2、3分。两项评分的乘积为最终的评分，总分范围0～12分，其中6～12分为强阳性(+++)，3～5分为中等阳性(++)，1～2分为弱阳性(+)，0分为阴性(-)，同时将中等阳性及以下记为“低表达组”，强阳性为“高表达组”。

1.2.3临床资料收集及随访 采用联合自制问卷调查表和临床病历，对纳入的86例行腹腔镜下根治手术患者的一般资料进行详细记录。同时均要求经规范治疗后，采用电话或门诊复诊等方式进行随访，术后2年内每3个月随访1次，2年以上每半年随访1次，随访开始于手术当日，随访截止时间为2021年7月31日，100%的患者有完整的随访信息。无病生存期(DFS)和总生存期(OS)为主要的研究终点，其中DFS指从随机化开始到第一次肿瘤复发或任何原因所致死亡的时间，DFS率为DFS内存活个体所占的百分比[8]；OS是指从随机化开始至任何原因所致死亡的时间，OS率为OS内存活个体所占的百分比[9]。

2 结 果

2.1不同病理组织中Nrf2、HO-1免疫组织化学染色评分比较 免疫组织化学染色评分结果显示，结直肠癌组织中Nrf2、HO-1的评分比癌旁组织低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同病理组织中Nrf2、HO-1免疫组织化学染色评分比较[M(P25,P75)，分]

2.2结直肠癌组织中Nrf2、HO-1表达与临床病理特征的关系 根据免疫组织化学染色结果判定标准，结直肠癌组织中Nrf2、HO-1的低表达率分别为63.95%(55/86)、66.28%(57/86)。进一步分析发现，结直肠癌组织中Nrf2、HO-1的表达与患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤最大径、分化程度及淋巴结转移等临床病理参数无关(P>0.05)；而Nrf2、HO-1低表达患者肿瘤浸润深度T3～T4、脉管浸润及TNM分期Ⅲ期例数均高于高表达患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 结直肠癌组织中Nrf2、HO-1表达与临床病理特征的关系(n)

2.3结直肠癌组织中Nrf2、HO-1表达与患者预后的关系 86例结直肠癌患者中，组织中Nrf2、HO-1呈现异常低表达的患者分别有55、57例，DFS率分别为49.09%(27/55)、50.88%(29/57)，OS率分别为38.18%(21/55)、38.60%(22/57)；Nrf2、HO-1高表达患者分别有31、29例，DFS率分别为74.19%(23/31)、75.86%(22/29)，OS率分别为67.74%(21/31)、68.97%(20/29)。Kaplan-Meier生存分析显示，结直肠癌组织中Nrf2、HO-1低表达组患者的DFS率、OS率均低于高表达组(DFS率：Log-rankχ2=5.139、4.970，P=0.022、0.030；OS率：Log-rankχ2=6.936、7.098，P=0.009、0.006)，见图1～4。将结直肠癌患者临床资料及生化指标纳入Cox单因素分析，结果显示，结直肠癌患者TNM分期Ⅲ期、淋巴结转移分级N2～N3、有脉管浸润、浸润深度T3～T4及组织中Nrf2低表达、HO-1低表达是DFS和OS的危险因素(P<0.05)，见表3；对单因素分析结果中差异有统计学意义的变量进行多因素分析，结果显示，TNM分期Ⅲ期及组织中Nrf2低表达、HO-1低表达均为结直肠癌患者DFS和OS的独立危险因素(P<0.05)，见表4。

图1 结直肠癌组织中Nrf2表达与患者DFS率的关系

图2 结直肠癌组织中HO-1表达与患者DFS率的关系

图3 结直肠癌组织中Nrf2表达与患者OS率的关系

图4 结直肠癌组织中HO-1表达与患者OS率的关系

表3 影响结直肠癌患者预后的单因素分析

表4 影响结直肠癌患者预后的多因素分析

3 讨 论

在消化道恶性肿瘤中，结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，而该病的发生需经历一个长期的发展过程，因此早期发现并明确结直肠癌复发、转移风险是优化患者治疗结局的最可靠方式，寻找简单、高效、可重复的检查手段是目前临床研究的重点[10-11]。近年来，随着对抗氧化系统研究的深入，人们发现肺癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞的恶性生物学行为似乎与氧化应激密切相关，考虑可能为氧化应激环境的作用促进了肿瘤的血管生成及远处转移[12]。AQUILANI等[13]通过一项回顾性研究证实，结直肠癌患者处于氧化应激状态，而经过奥沙利铂-氟嘧啶联合疗法治疗后，此类患者抗氧化能力得到显著提高且生存获益。YAO等[14]研究发现，在所有阶段的结直肠癌患者中，其氧化损伤标志物水平升高，而抗氧化标志物水平降低，同时该研究提出氧化-抗氧化概况可作为诊断、治疗、生存和复发的标志物。但上述观点多停留于研究氧化应激在促进结直肠组织癌变的相关领域，而对结直肠癌患者复发转移风险及预后判断的研究却报道较少，且其具体分子机制仍尚未明确。本研究结果发现，结直肠癌组织中Nrf2、HO-1的表达比癌旁组织高(P<0.05)，提示Nrf2、HO-1表达异常可为辅助判断结直肠癌患者发生、发展提供一定参考。基于此，本研究拟从氧化应激角度探讨组织中氧化应激因子Nrf2、HO-1的异常表达与结直肠癌根治术患者临床病理特征及预后的可能关系。

Nrf2/ARE是目前发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路，其中Nrf2是该通路家族成员中活力最强的转录因子，生理状态下，Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)处于偶合状态，并被固定在主要由肌动蛋白构成的细胞骨架上，通过泛素化降解Nrf2而维持细胞质中的Nrf2处于基础水平[15]。一旦受到亲电试剂刺激后，Keap1/Nrf2解偶联，Nrf2发生磷酸化，并移位至细胞核，与基因中的Maf蛋白相结合，形成异二聚体[16]。而异二聚体可与ARE启动子部位结合，启动下游蛋白酶体、泛素酶及Ⅱ相解毒酶等抗氧化靶基因的表达。HO-1就是其众多靶基因中重要的一种，可借助还原型辅酶Ⅱ或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸作为其电子供体，对醌类及其衍生物产生催化作用，使其失去2个电子从而被还原为水合醌类，进一步阻止了醌类及其衍生物继续参与氧化还原反应，从而保护细胞免受一系列过氧化损伤[17]。由于肿瘤微环境中的氧化应激在疾病发生、发展中的作用，故探究Nrf2/ARE的第一信号途径亦有重要价值[18-19]。Nrf2/ARE的第一信号途径在恶性肿瘤患者中的异常表达已经被明确，但是其在结直肠癌根治术患者组织中的表达研究及对不良预后的指向性则涉及不多。在本研究中，通过分析86例结直肠癌组织中Nrf2、HO-1表达及其与患者临床病理特征和预后的关系，发现Nrf2、HO-1的表达水平在结直肠癌患者中异常降低。肿瘤浸润深度、脉管浸润、TNM分期都反映恶性肿瘤的迁移发展能力，而本研究结果显示上述临床病理特征与结直肠癌根治术患者组织中Nrf2、HO-1的低表达有关。进一步的单因素和多因素Cox分析亦证实，结直肠癌根治术患者Nrf2、HO-1的异常低表达是影响其DFS和OS的独立危险因素，说明Nrf2、HO-1在此过程中发挥着关键性作用。以上研究结果均证实了Nrf2、HO-1在结直肠癌中扮演着抑癌基因的角色，这与其在胰腺癌[20]、脑胶质瘤[21]、非小细胞肺癌[22]中的效应类似。

综上所述，本研究通过对86例结直肠癌患者的生存资料进行统计学分析，发现Nrf2、HO-1在结直肠癌组织中呈低表达，证实了Nrf2、HO-1表达与多种不良临床病理特征及患者的不良预后有关，这将有助于研究特异性的抗肿瘤转移、耐药性药物，亦可能对此类患者术后死亡及复发转移风险的预测有指导性作用。然而，本研究仅局限于临床标本分析，且样本量相对较小，再加之操作测量误差等也可能会影响研究结果的准确性；同时，未对Nrf2、HO-1介导结直肠癌发生、发展的分子机制进行进一步的探索和验证；尽管如此，本研究所获得的数据成果也为临床探索Nrf2、HO-1在结直肠癌中的分子功能及潜在机制奠定了一定基础。在未来，本课题组将在细胞及动物水平上，探讨Nrf2、HO-1抑制结直肠癌的潜在分子机制；同时也将收集更多临床标本对本研究结果进行进一步验证。