诃子乙醇提取物联合卡培他滨对小鼠4T1乳腺癌转移瘤的抑瘤效果评价＊

马娅楠，马生萍，陈建春，李 念，殷祎隆

（西北民族大学医学院，甘肃 兰州 730030）

乳腺癌是当今女性发病率最高的恶性病之一。有研究发现多药联合对于三阴性乳腺癌的治疗有明显的抑制作用[1]。诃子是一种中药，在蒙药和藏药中应用甚广，其活性成分通过抑制血管生成,增强组织免疫力来发挥抗肿瘤的作用[2]；卡培他滨[3]在临床上用于控制晚期乳腺癌的发生发展，因其为氟尿嘧啶类衍生物，经羧基酯酶、胞苷脱氨酶及胸腺嘧啶磷酸化酶（TP）等一系列酶促反应可转化为5-Fu，抑制DNA合成，还可减少患者胃肠道不适等不良反应。推测诃子联合卡培他滨对乳腺癌的发生发展有更好的抑制作用。本研究的目的是观察诃子乙醇提取物联合卡培他滨对4T1乳腺癌的抑瘤效果，并通过检测小鼠外周血清中的TNF-α、INF-γ、IL-4和VEGF的含量，来探讨其是否对4T1乳腺癌有抑制作用，以便为临床治疗乳腺癌提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药物

诃子果实5 kg（购自甘肃中医药大学）。

1.1.2 实验动物

75只健康雌性BALB/c小鼠，6～8周龄（购自甘肃省新熙盛生物科技公司）。

1.1.3 试剂与仪器

4T1乳腺癌细胞株（购自甘肃惠博斯实验器材经营部）；胎牛血清、1 640培养基及小鼠肿瘤坏死因子（TNF-α）、小鼠白介素-4（IL-4）、大鼠血管内皮生长因子（VEGF）、小鼠γ干扰素（IFN-γ）ELISA试剂盒均购自莱德公司；酶标仪（美国Bio Rad公司，型号iMark）、恒温培养箱（上海精宏设备公司，型号DNP-9022）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf，型号5424R）、摇床（美国SCILOGEX仪器，型号SK-O180-E）、超低温冰箱（中科美菱低温科技公司，型号DW-HL528）。

1.2 方法

1.2.1 细胞传代培养

将复苏的4T1乳腺癌细胞（来源于BALB/c小鼠的癌变乳腺组织）在10%胎牛血清的1 640培养基中进行传代培养，观察其贴壁情况并进行传代，到第4代后取对数生长期的肿瘤细胞用于实验，待细胞数量增长并贴满细胞培养瓶瓶壁时，用胰酶消化液将贴壁的肿瘤细胞消化下来并且反复吹洗使其成为细胞悬液，将细胞悬液进行显微镜下计数，细胞浓度调整为2×106个/mL。

1.2.2 药物制备

诃子果实粉碎后用60%乙醇加热回流提取3次,合并提取液,浓缩后加入等量的95%乙醇搅匀,静置过夜后滤过，滤渣用60%乙醇洗涤,洗液与滤液合并,减压回收乙醇,干燥得提取物2.5 kg备用。

1.2.3 建立小鼠4T1乳腺癌模型及模型评定

将75只实验小鼠随机分成5组，即空白组、模型组、卡培他滨组、诃子组和联合组（卡培他滨+诃子），每组15只；每天给予等量的食物与水，相隔2 d更换垫料，同时对鼠笼以及盛水器具进行消毒。待小鼠完全适应环境后按照预实验的步骤取配制好的乳腺癌4T1细胞悬液，以0.2 mL/只的量注射于各组小鼠左侧腋部皮下。一般在5～7 d后，荷瘤大小为5 mm×5 mm×5 mm即代表建模成功，并开始测量及记录其长短径和体重。在建模成功后开始对小鼠进行灌胃，灌胃时间固定在每天早晨9：00—11:00，连续灌胃5 d后休息2 d。灌胃方法为空白组和模型组：生理盐水；卡培他滨组：50 mg·（kg·d）-1的卡培他滨片+生理盐水悬浊液；诃子组以每只小鼠50 mg·（kg·d）-1/只/的诃子乙醇提取物与生理盐水悬浊液灌胃；联合组：50 mg·（kg·d）-1的卡培他滨片+诃子乙醇提取物+生理盐水悬浊液，各组给药剂量均为1 mL/只。每日观察小鼠生活饮食和精神状况，密切关注接种部位的瘤结节生长情况，腋下触及质软小结节。于灌胃后第21 d先行眼球取血，之后脱颈处死小鼠，取脾、胸腺备用。

1.2.4 检测指标和方法

①瘤体体积与抑瘤率 荷瘤生长情况分别用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）、短径（b），根据公式（V=ab2/2）计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线[4-5]。将剥离瘤体去除脂肪及血污后称重，计算抑瘤率（%）[（模型组瘤质量-治疗组瘤质量）/模型组瘤质量×100%]。

②胸腺指数与脾脏指数 将分离出的胸腺、脾脏称重，计算胸腺指数（mg/g）［胸腺质量（mg）×10/小鼠体质量（g）］和脾脏指数（mg/g）［脾脏质量（mg）×10/小鼠体质量（g）］［6］。

③肿瘤组织HE染色切片 将小鼠肿瘤组织和脏器标本装入盛有4%多聚甲醛固定液标本瓶中保存，经固定后，常规石蜡包埋再切成4 μm的薄片，切片用二甲苯脱蜡，再用各级的乙醇水洗，把水吸干后，用苏木精-伊红（HE）染色[7]后在显微镜下观察。

④肿瘤肺转移鉴定 将所有小鼠的同一侧肺叶，在显微镜下观察肺表面转移结节并计数；小鼠肺组织放入提前配制好的固定液中固定，再经脱水、透明、浸蜡等过程后待其形成蜡块进行切片、制片，HE染色镜检评价模型[8]。

1.3 统计学方法

数据用SPSS 19.0统计软件进行分析。计数资料采用χ2检验的方法进行分析；计量资料以均数±标准差（）表示,四组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

由于在实验后期各组均有1～2只小鼠的死亡，为各组数据的均衡，实验小鼠的样本统一为每组13只。

2.1 药物干预对各组小鼠肿瘤体积、瘤重和抑瘤率的影响

由表1可见，4组小鼠瘤体体积（P<0.01）以及各组瘤重（P<0.05）间的差异均有统计学意义；各药物干预组小鼠的瘤体体积均小于模型组（P均<0.01），诃子组与联合组瘤重小于模型组（P<0.05），卡培他滨组小鼠瘤重小于模型组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各药物干预组瘤体体积、瘤重的比较（）

表1 各药物干预组瘤体体积、瘤重的比较（）

与模型组相比**P＜0.01

各组在荷瘤早期肿瘤生长速度都很快，在荷瘤中期诃子组和联合组的生长速度逐渐减慢且相近，在荷瘤末期卡培他滨组和诃子组生长速度相当，相比较而言联合组速度最慢。

基于模型组的数据，各药物干预组的抑瘤率分别是卡培他滨组（3.42%）＜诃子组（18.58%）＜联合组（28.05%）。

2.2 药物干预对各组小鼠胸腺和脾脏指数及肺结节的影响

由表2可得，各组小鼠胸腺指数差异无统计学意义（P>0.05）;各组小鼠脾脏指数和肺结节差异有统计学意义（P<0.05）;脾脏指数：与模型组相比，空白组脾脏指数最低（P<0.01），药物干预后脾脏指数相比阴性组均有降低，组间两两比较诃子组的脾脏指数小于卡培他滨组具有统计学意义（P<0.01）；肺结节：与模型组相比，联合组肺结节个数减少，差异显著（P<0.01）。

表2 各药物干预组胸腺、脾脏指数及肺结节变化情况(）

表2 各药物干预组胸腺、脾脏指数及肺结节变化情况(）

注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与卡培他滨组相比，△△P＜0.01

2.3 各组小鼠TNF-a、IL-4、VEGF、INF-γ的变化情况

由表3可得，各组TNF-a、IL-4、VEGF、INF-γ的表达差异具有统计学差异（P均<0.01）；与空白组相比，模型组TNF-a、IL-4、VEGF均升高而INF-γ的表达降低具有统计学意义（P<0.05）；各药物干预组与阴性组相比：联合组、诃子组TNF-a降低具有明显的统计学意义（P<0.01）；联合组、卡培他滨组IL-4降低，差异显著（P<0.01）；各药物干预组VEGF均降低（P<0.05），其中联合组与诃子组降低明显（P<0.01）；卡培他滨组INF-γ升高，差异具有统计学意义（P<0.01）。

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表3 各组INF-γ、IL-4、TNF-α、VEGF在4T1乳腺癌荷瘤小鼠中的表达(）

表3 各组INF-γ、IL-4、TNF-α、VEGF在4T1乳腺癌荷瘤小鼠中的表达(）

注：与空白组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.4 各药物干预组的组织病理学结果

2.4.1 三阴性乳腺癌肺转移标本的HE切片

模型组：肺转移灶的数目较多、直径较大，且易见侵犯细支气管及侵犯血管壁的现象，肿瘤细胞异型性明显、有核分裂相。

诃子组：与阴性组比肺转移灶的数目及转移灶的直径未见明显差别，肿瘤细胞异型性明显、核分裂相常见，可见到侵犯血管壁的现象。和阴性组比转移瘤的癌巢内浸润的炎细胞明显增多。

卡培他滨组：与阴性组比癌细胞出现变性，可见到较大面积的坏死，局部侵犯血管及细支气管的癌细胞变性较为明显，且有大量的炎细胞浸润。

联合组：与各单独用药组相比癌巢的体积变小，且局部癌细胞变性的面积与卡培他滨组相比增大。

2.4.2 三阴性乳腺癌种植瘤标本的HE切片

模型组：瘤细胞异型性明显，核仁清晰、核分裂相常见。

诃子组：大部分区域瘤细胞异型性明显，核仁清晰、核分裂相常见，少部分区域可见点状坏死，及炎细胞浸润。

卡培他滨组：瘤细胞异型性明显，核仁清晰、核分裂相较少，局部组织出现片状坏死。

联合组：瘤细胞异型性明显，核仁清晰、核分裂相常见，未见明显坏死，与阴性组比较无明显差别。

3 讨论

乳腺癌作为女性群体高发病，近年来的发病率呈逐渐上升的趋势。乳腺癌的发生与多种因素相关[11]。在各种因素的作用下，乳腺癌被分为四型，其中，以Ⅳ型恶性程度最高，因雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、原癌基因（Her-2）均为阴性，因此也叫三阴性乳腺癌。三阴性乳腺癌因其高转移率、高致死率及预后差[12]等特征，受到国内外学者广泛关注。4T1乳腺癌细胞作为一种普遍被应用于三阴性乳腺癌模型建立的细胞，常规应用于BALB/C小鼠[13-17]。

本实验研究结果表明：诃子、卡培他滨两药联合均对荷瘤小鼠瘤体体积及瘤重的增长具有抑制作用，联合组的瘤体体积和瘤重差异最明显，在生长曲线上的表现也印证了这一点；脾脏指数：荷瘤后各组脾脏指数均升高，各药物干预组脾脏指数的升高低于模型组，说明荷瘤后小鼠免疫亢进，药物干预对机体的过度免疫反应具有缓解作用；肺结节转移：联合组肺结节转移数的降低具有明显差异，两药联合应用有降低肺部转移率的功效。在病理切片上联合组转移癌巢平均体积也最小，证明诃子联合卡培他滨降低肺部转移率同时对已转移组织的癌细胞生长也具有一定的抑制功效。

据相关文献记载，抗原已致敏的CD4+Th细胞，在局部微环境如细胞因子的作用下可选择性分化为Th1细胞或Th2细胞，Th1细胞通过其主要执行细胞因子INF-γ介导细胞免疫的发生；Th2细胞主要执行细胞因子IL-4介导体液免疫的发生[18]；TNF-α作为一种重要的促炎介质，可以增加中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞的浸润；VEGF会增加血管的生成，可以通过血管生成促进肿瘤的发生发展[19]。

以上结果说明4T1乳腺癌可以促进小鼠体内TNF-a、IL-4、VEGF大量表达引起荷瘤小鼠炎症反应与体液免疫的亢进，同时，通过降低INF-γ抑制机体的细胞免疫。药物干预后，单独用药或联合用药均可使荷瘤小鼠TNF-a、IL-4、VEGF的过度表达在一定程度上受到抑制，联合组抑制效果最为显著，此外卡培他滨INF-γ表现为荷瘤后的去抑制效果；表明诃子组可以通过抑制TNF-a与VEGF的表达削弱过度炎症反应对机体的不利影响达到抗肿瘤效应，这与诃子的活性成分可以通过抑制VEGFR-2受体活化来抑制血管生成[20]，使肿瘤的生长受限的研究结果基本一致；卡培他滨组抑制机体IL-4、VEGF同时促进INF-γ的表达，通过缓解体液免疫的亢进、降低血管生成以及抵抗肿瘤对机体细胞免疫抑制而发挥效应；联合组则通过同时抑制TNF-a、IL-4、VEGF表达来发挥抗肿瘤生长及抑制肺部转移的作用。有研究发现[21]炎症反应通过增强巨噬细胞的能力来增强小鼠的免疫力以抗肿瘤，本实验的病理结果提示两单独用药组较模型组相比炎性细胞的浸润也确实增加，但在联合组却并未发现炎症细胞相对模型组较为明显的浸润现象，与免疫学结果之间的差异尚需增加样本进一步验证与探究。

综上所述，诃子联合卡培他滨可以通过降低机体TNF-a、IL-4、VEGF的表达来抑制乳腺癌生长与转移，也在一定程度上提示了两药联合对4T1乳腺癌的抑制效果与TNF-a、IL-4、VEGF降低程度的正相关关系。本实验再次验证了中药联合化疗抗肿瘤在肿瘤治疗方面的相对优越性[22]，若应用于临床能减轻患者病痛，增加治愈率，也可再一次提升中西医结合抗肿瘤在临床上的重视度与认可。