基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS技术的乔林与叶林杜仲叶次生代谢产物比较研究

申梦园，吴 蓓，段涵琪，杨放晴，王 福，陈鸿平，刘友平

1西南特色中药资源国家重点实验室；2成都中医药大学药学院，成都 611130

杜仲叶为杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv的干燥叶，于2005版《中华人民共和国药典》中首次收载入药，具有补肝肾，强筋骨的功效[1]。主要成分为苯丙素类、黄酮类、环烯醚萜类及有机酸类等[2]。杜仲传统药用部位为皮，由于环剥技术的不规范使得大量的杜仲皮遭到严重破坏，难以再生。杜仲叶有较强的再生能力，产量巨大，目前有关杜仲叶成分的研究多有报道[3]。

杜仲根据栽培方式不同分为乔林和叶林杜仲，乔林杜仲是高25 m以上的传统杜仲树，以经营木材为目的，生长周期长，采叶困难[4]，导致杜仲叶投入与产出效率相对较低，为此人们在科学技术水平上进行创新，将乔林杜仲进行矮化密植形成叶林杜仲，使产叶量增大，经营周期缩短，采叶方便[5]。目前叶林杜仲已在湖北勋西、河南汝阳、灵宝，陕西略阳等地大规模人工栽培[6]。我国药典尚未对杜仲叶的栽培方式提出明确要求，对于乔林与叶林杜仲叶的植物代谢组是否有差异，已有文献对乔林与叶林杜仲叶中绿原酸、京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷及总黄酮进行了研究，发现不同产地、不同采收时间杜仲叶中总黄酮、绿原酸、京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷含量变化不一[7,8]，这些研究为乔林杜仲叶与叶林杜仲叶化学成分的深入奠定了基础，但研究指认的成分较少，难以全面有效阐明杜仲叶成分谱的变化。

本实验将在前人研究的基础上以四川省旺苍县和通江县两个产地的3年生乔林杜仲叶和新引种的叶林杜仲叶为研究对象，通过超高效液相-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱技术对乔林与叶林杜仲叶进行无差别代谢全成分分析。并结合化学模式识别技术对两种栽培方式的杜仲叶进行比较研究，以期为杜仲叶用模式合理栽培和利用提供理论基础。

1 材料与方法

Vanquish型超高效液相色谱联用Q-Exactive型四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；L-100型高速多功能粉碎机(上海冰都电器有限公司)；UPTUO-I-1000TE超纯水制备仪(成都超纯科技有限公司)；BT125D型十万分之一电子天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司)；Ultrasonic Cleaner型超声机(功率100 W，50 Hz)。

绿原酸(批号：CHB190121)；芦丁(批号：CHB190110)；京尼平苷酸(批号：CHB201202)；咖啡酸(批号：CHB180308)；儿茶素(批号：CHB180809)；二氢槲皮素(批号：CHB190105)；阿魏酸(批号：wkq21010504)；车叶草苷(批号：CHB180522)；阿魏酸对照品购自四川省维克奇生物科技有限公司；其余均购自成都克罗马生物科技有限公司；纯度均≥98%。乙腈(美国Fisher Chemical，色谱纯)；甲醇(北京化工厂，分析纯)；实验用水为超纯水。

杜仲叶药材采自四川省广元市旺苍县深溪村杜仲试点种植基地和四川省巴中市通江县石婆山杜仲规模化种植基地，经成都中医药大学严铸云教授鉴定为杜仲科植物杜仲E.ulmoidesOliv的干燥叶，于实验室药材储藏室保存。每个产地定点采集五棵乔林树杜仲叶和五棵叶林树杜仲叶，为了尽可能消除杜仲树个体间的差异，同一产地同种栽培方式的杜仲叶粉末取等量混合均匀，平均分成三份。样品信息如表1所示。

表1 杜仲叶样品收集信息

1.1 溶液配制

1.1.1 供试品溶液

精密称取混合均匀的杜仲叶粉末约1 g(过3号药典筛)，置于具塞锥形瓶中，精密加50%甲醇20 mL，超声处理1.5 h(500 W，40 kHz)后，放凉，补足失重，滤过，离心(10 000 r/min，10 min，4 ℃)，取滤液过0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

1.1.2 对照品溶液

分别取绿原酸、芦丁、京尼平苷酸、儿茶素、二氢槲皮素、阿魏酸、车叶草苷、咖啡酸对照品适量，分别置1 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，所得对照品溶液浓度分别为1.09、0.57、1.18、0.72、0.38、0.49、0.66、1.24 mg/mL，置于4 ℃的冰箱中冷藏保存。

1.2 检测条件

1.2.1 色谱条件

Vanquish型超高效液相色谱联用Q-Exactive 型四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪，Agilent Extend-C18色谱柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)，流动相 0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱(0～15 min，7%→18% B；15～35 min，18%→25% B；35～45 min，25%→35% B；45～50 min，35%→45% B)，流速0.8 mL/min，柱温35 ℃，进样量3 μL。检测波长254 nm。

1.2.2 质谱条件

采用电喷雾离子源(ESI)，正、负离子切换模式扫描，扫描范围100～1 500m/z，Full MS一级分辨率35 000，二级分辨率17 500；正负离子同时扫描，喷雾电压为3.5 kV；离子源温度350 ℃，鞘气流速35 arb，辅助气流速10 arb，离子传输管温度320 ℃。S 状透镜电压(S-Lens)50 V，碰撞能量梯度为20、40、60 eV。

1.2.3 数据处理

利用Compound Discoverer 3.0软件将UPLC-Q-Orbitrap HRMS所采集的原始数据提取拟合出分子式和一级质谱的精确相对分子质量，将所得结果与mzCloud，mz Vault，ChemSpider数据库及本地中药成分高分辨质谱数据库OTCML 进行匹配，对匹配结果设置过滤参数：峰面积阈值8万，一级准分子离子及二级碎片离子质量偏差5 ppm(1 ppm=1×10-6)，匹配度分值>80。将过滤后的目标化合物的碎片离子信息与对照品及相关参考文献信息进行比对，对化合物鉴定。

2 结果与分析

杜仲叶UPLC-Q-Orbitrap HRMS的总离子流图(total ion chromatograms，TIC)如图1和图2所示。乔林与叶林杜仲叶的化学成分在物质种类上较为一致如图3所示。其中共有成分有62种，黄酮类9种，苯丙素类9种，环烯醚萜类2种，有机酸类21种，香豆素类5种，其他类16种，结果见表2。其中8种成分与对照品比对而确认，其余化合物结合数据库及参考文献鉴定。

图1 在UPLC-Q-Orbitrap HRMS负离子模式下通江县乔林杜仲叶的总离子流图

图2 在UPLC-Q-Orbitrap HRMS正离子模式下通江县乔林杜仲叶的总离子流图

图3 负离子模式下通江县乔林与叶林杜仲叶层叠图

表2 杜仲叶化学成分的质谱信息

3.1 黄酮类化合物裂解途径

黄酮类化合物是一类含有2-苯基色原酮结构的化合物，主要包括黄酮苷元和黄酮苷类。在负离子模式下，黄酮苷类化合物首先易脱去糖基，而后进行黄酮苷元的裂解，黄酮苷元类裂解方式主要有两种：一是脱去CO、CO2、H2O、C2H2O等中性离子；二是发生狄尔斯-阿尔德(RDA)裂解，C环裂开产生具有特征性的二级碎片，此裂解方式也是黄酮类化合物的主要裂解规律。本研究共鉴定和推测出9种黄酮类化合物。以化合物51号为例，在负离子模式下的准分子离子峰为m/z609.146 7[M-H]-，可推测其分子式为C27H30O16，失去C12H21O9，形成二级碎片例子m/z300.027 8[M-H-C12H21O9]-，失去C12H22O9、CO，形成二级碎片离子m/z271.025 1[M-H-C12H22O9-CO]-、m/z243.029 8[M-H-C12H22O9-CO-CO]-，失去C12H22O9、CO、C7H5O2、CO2，形成二级碎片离子m/z151.003 2[M-H-C12H22O9-CO-C7H5O2]-、m/z107.012 9[M-H-C12H22O9-CO-C7H5O2-CO2]-、m/z255.030 0[M-H-C12H22O9-CO2]-；根据文献报道及对照品比对后确定该化合物为芦丁，其二级碎片图及裂解规律简图4、5。

图4 芦丁二级质谱图

3.2 苯丙素类化合物裂解途径

苯丙素类化合物是形成木质素的前体，在杜仲叶中含量较高。通过参考文献及对照品比对从杜仲叶中鉴定出了9种苯丙素类化合物。以化合物36为例，在负离子模式下形成准分子离子峰为m/z353.088 2[M-H]-，推测其分子式为C16H18O9，在二级质谱中，依次丢掉C9H6O3、H2O形成碎片离子m/z191.055 8[M-H-C9H6O3]-、m/z173.045 0[M-H-C9H6O3-H2O]-；连续脱掉C7H10O5、CO2形成碎片离子m/z179.034 6[M-H-C7H10O5]-、m/z135.044 5[M-H-C7H10O5-CO2]-；根据文献报道及对照品比对后确定化合物36号为绿原酸，其二级碎片图及裂解规律如图6、7所示。

图5 芦丁质谱裂解途径

图6 绿原酸二级质谱图

图7 绿原酸质谱裂解途径

3.3 环烯醚萜类化合物裂解途径

环烯醚萜类化合物的裂解表现为中性失去母环上的功能基团H2O、CO2、CH3COOH和糖单元等以及糖苷键断裂，中性丢失葡萄糖残基(-C6H10O5，-Glu)或葡萄糖(-C6H12O6，-Gluconse)。在负离子模式下从杜仲叶中共鉴定出2种环烯醚萜类：化合物22和38。以化合物22为例，在负离子模式下的准分子离子峰为m/z373.114 3[M-H]-，推测出其分子式为C16H22O10，脱去葡萄糖残基得m/z211.061 1[M-H-Glu]-，后再脱去CO2、H2O形成碎片离子m/z167.071 0[M-H-Glu-CO2]-、m/z123.044 4[M-H-CO2-CO2]-、m/z193.050 7[M-H-Glu-H2O]-、m/z149.060 2[M-H-Glu-H2O-CO2]-；根据文献报道及对照品比对后确定化合物22为京尼平苷酸。其二级碎片图及裂解规律图如图8、9示。

图8 京尼平苷酸二级质谱图

图9 京尼平苷酸质谱裂解途径

3.4 有机酸类化合物裂解途径

有机酸是一类具有羧基，酚羟基等酸性基团有机化合物。二级质谱裂解特征主要为先失去糖苷、酰基，而后丢掉CO、OH、H2O、CO2、HCOOH等中性分子，从杜仲叶中共鉴定出21种有机酸类化合物。以化合物6为例，其在负离子模式下形成准分子离子m/z191.055 8[M-H]-，推测其分子式为C7H12O6；在二级质谱中，丢掉H2O、HCOOH、CO形成碎片离子m/z173.055 8[M-H-H2O]-、m/z127.039 3[M-H-H2O-HCOOH]-、m/z85.028 6[M-H-H2O-HCOOH-H2O-CO+H]-。根据文献报道，确定化合物6为D-(-)-奎尼酸。其二级碎片图及裂解规律图如图10、11所示。

图10 D-(-)-奎尼酸二级质谱图

图11 D-(-)-奎尼酸质谱裂解途径

3.5 香豆素类化合物裂解途径

香豆素指含有苯骈α-吡喃酮母核的肉桂酸型衍生物，具有芳香气味。根据取代基的不同可分为简单香豆素、呋喃香豆素、吡喃香豆素以及其他香豆素类。尽管香豆素取代位点和取代基不同，但它们的断裂模式具有一定的规律。香豆素的基本骨架很难被断裂，主要是通过丢失-CH3、-CO、-CO2和H2O等小分子基团来产生碎片离子。本实验共鉴定了5种香豆素类成分。以化合物47为例，在正离子模式下准分子离子峰为m/z163.039 1，可推测其分子式为C9H6O3，在正离子模式下失去H2O、CO分别形成二级碎片离子。m/z135.044 2[M+H-CO]+、m/z107.049.5[M+H-2CO]+、m/z117.033.8[M+H-2CO-H2O]+、m/z145.028 5[M+H-H2O]+、m/z89.039 2[M+H-2CO-H2O]+，根据参考文献比对推测出该化合物为7-羟基香豆素。其二级碎片图及裂解规律如图12、13所示。

图12 7-羟基香豆素二级质谱图

图13 7-羟基香豆素质谱裂解途径

3.6 其他类化合物裂解途径

其他类化合物共鉴定出16种。以化合物10为例，其在负离子模式下可形成准分子离子m/z191.019 4[M-H]-，可推测其分子式为C6H8O7；在二级质谱中，可推测其丢失H2O、CO2、C2H2O形成碎片离子m/z173.009 0[M-H-H2O]-、m/z129.018 6[M-H-H2O-CO2]-、m/z111.008 0[M-H-H2O-CO2-H2O]-、m/z87.007 9[M-H-H2O-CO2-C2H2O]-；根据文献报道可推测出该化合物为柠檬酸，其二级碎片图及裂解规律图如图14、15所示；化合物3在正离子模式下准分子离子为m/z127.039 2[M+H]+，推测其分子式为C6H6O3，二级质谱中依次失去H2O，CO形成碎片离子m/z109.028 8[M+H-H2O]+、m/z81.034 1[M+H-H2O-CO]+，根据文献报道确定化合物3为5-羟甲基-2-糠醛。其二级碎片图及裂解规律图如图16、17所示。

图14 柠檬酸二级质谱图

图15 柠檬酸质谱裂解途径

图6 5-羟甲基-2-糠醛二级质谱图

图17 5-羟甲基-2-糠醛质谱裂解途径

3.7 乔林与叶林杜仲叶主成分分析

将上述杜仲叶样品63个共有成分的峰面积导入SIMCA14.1软件，通过主成分分析初步判断各样本的聚集情况，反映组内和组间差异。PCA拟合的模型R2X=0.954，Q2=0.745，均>0.5，表明该模型具有较好的预测能力。由PCA得分图(见图18)可看出，旺苍乔林杜仲叶、旺苍叶林杜仲叶、通江乔林杜仲叶和通江叶林杜仲叶各自都能很好地聚为一类，且乔林杜仲叶与叶林杜仲叶在t[1]主成分方向区分明显，叶林杜仲叶分布在t[1]轴右侧，乔林杜仲叶分布在t[1]轴左侧。

图18 杜仲叶PCA得分散点图

3.8 乔林与叶林杜仲叶正交偏最小二乘法-判别分析

为了更好地突出乔林杜仲叶与叶林杜仲叶的组间差异，寻找差异成分，将杜仲叶样品中63个共有峰峰面积导入SIMCA14.1软件，进行有监督的正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)。采用常用变量重要性投影(VIP)值反映代谢物对组分的贡献性大小，一般认为VIP>1的变量对组分有显著贡献，OPLS-DA拟合的模型R2X=0.735，R2Y=0.95，Q2=0.867，均>0.5，表示该模型的预测能力较强，可以作为两种栽培方式杜仲叶的模式识别方法，杜仲叶样品OPLS-DA得分散点图如图19所示。VIP结果见图20，最终在正负离子模式下共筛选出10个差异性成分，分别是D-(-)-奎尼酸、柠檬酸、α，α-海藻糖、葡萄糖酸、芦丁、3，4-二甲基苯甲酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、4-甲基伞形酮、4，5-二咖啡酰奎宁酸、3′，4′-二羟基苯丙酮，这些成分可作为区分乔林与叶林杜仲叶的特征性成分。

图19 杜仲叶OPLS-DA得分散点图

图20 不同栽培方式杜仲叶差异成分VIP图

3.9 统计学分析

为比较上述对两种栽培方式影响较大的10种成分是否具有显著差异，采用SPSS24.0软件，对10种差异成分色谱峰的峰面积进行两独立样本t检验，P<0.05表示具有显著差异，以峰面积为纵坐标，主要差异成分为横坐标，绘制乔林和叶林杜仲叶差异成分柱形图。

由图21可知，两种栽培方式中的主要差异成分葡萄糖酸(1)、D-(-)-奎尼酸(6)、柠檬酸(10)、芦丁(51)、4，5-二咖啡酰奎宁酸(56)在乔林杜仲叶中含量相对较高，而叶林杜仲叶中α，α-海藻糖(2)、3，4-二甲基苯甲酸(31)、3′，4′-二羟基苯丙酮(15)、4-甲基伞形酮(20)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(53)的含量相对较高。其中D-(-)-奎宁酸、柠檬酸、3′，4′-二羟基苯丙酮、4-甲基伞形酮、4，5-二咖啡酰奎宁酸在两种栽培方式中的杜仲叶中存在显著差异，可见乔林与叶林杜仲叶中的主要成分存在有明显差异。

图21 不同栽培模式杜仲叶差异成分比较

3 讨论与结论

本文采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技术对乔林与叶林杜仲叶代谢轮廓和差异成分进行了全面分析。共鉴定了62个化合物，其中包括其9种黄酮类成分，9种苯丙素类成分，2种环烯醚萜类成分，21种有机酸类成分，5种香豆素类成分和16种其他类成分，其中香豆素类成分对香豆醛、7-羟基香豆素、6，7-二羟基香豆素、香豆素、4-甲基伞形酮为首次在杜仲叶中发现的成分，这些成分可能与其抗肿瘤和抗骨质疏松效果密切相关。

两种栽培方式下杜仲叶化学成分基本一致，但相对含量上存在差异，其中存在显著差异成分包括D-(-)-奎尼酸、柠檬酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、3′，4′-二羟基苯丙酮、4-甲基伞形酮。其中D-(-)-奎尼酸、柠檬酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸在乔林杜仲叶中含量相对较高，3′，4′-二羟基苯丙酮、4-甲基伞形酮在叶林杜仲叶中含量相对较高。这些成分在含量上的差异可作为区分乔林与叶林杜仲叶的特征性成分。其中D-(-)-奎尼酸为对映纯化合物如绿原酸、咖啡酰奎尼酸等合成中有用的手性源[28]，4，5-二咖啡酰奎宁酸具有抗氧化、抗炎等生物活性[29]，4-甲基伞形酮具有抗炎、抑制透明质酸等作用[30,31]，因此建议将D-(-)-奎尼酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、4-甲基伞形酮作为区分乔林与叶林杜仲叶的质量控制指标成分。现代药理研究表明D-(-)-奎尼酸具有增强胆汁降低脂肪，肝脏解毒，预防脂肪肝的作用[32]；4，5-二咖啡酰奎宁酸具有益气养阴，活血健脑的功效，用于治疗气阴两虚及心脑血管疾病等[33]，4-甲基伞形酮是一种透明质酸生物合成抑制剂，在体外具有一定程度的抗菌能力，在细胞水平具有肿瘤抑制作用[34]。本研究将乔林与叶林的杜仲叶区分开来，有利于更好地应用不同栽培方式下的杜仲叶的优势成分，为杜仲叶产品综合开发利用提供了一定的理论基础。

本研究采用超高效液相-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱法只能通过准分子离子及多级碎片离子对化合物进行预测，对于存在的同分异构体还需要进一步结合核磁共振技术进行鉴定。文献报道[7,8]，不同采收期、不同产地、不同树龄杜仲叶中成分具有差异性，下一步将通过UPLC-Q-Orbitrap HRMS技术对不同产地、不同采收期、不同树龄杜仲叶中全成分进行比较研究，为杜仲叶品质评价奠定基础。