丛枝菌根真菌对滇重楼根际土壤、须根和根茎中重金属元素的影响

郎佳琪，赵顺鑫，王 丹，李金金，黎海灵，周 浓，赵晶晶*，李雅南

1重庆三峡学院生物与食品工程学院，重庆 404120；2虎林市农业技术推广中心，虎林 158100

滇重楼(Parispolyphyllavar.yunnanensis)属于百合科重楼属多年生药用植物，其干燥根茎具有凉肝定惊、消肿止痛、清热解毒等功效[1]，以其独特疗效和低毒副作用受到了广泛关注和使用。随着制药工业需求量的逐年增加，造成了野生资源日益枯竭，故人工栽培滇重楼成了实现资源可持续利用的有效途径，通过生物技术来改善滇重楼药用品质已成为国内研究滇重楼规范化栽培体系的热点领域，也是实现野生资源有效保护和资源可持续利用的必由之路[2,3]。

随着工业迅速发展以及化肥、农药大量施用导致土壤重金属污染问题日益严重，土壤中重金属只能在环境中迁移，不能被土壤微生物分解而不断积累，当重金属积累量达到一定限度时就会对植物系统产生毒害效应，再通过食物链危害人类生命健康[4]。例如，镉(Cd)元素超标会诱导糖尿病、生殖毒性、骨质疏松症、肾功能损伤以及脾肝等器官致癌[5]，汞(Hg)元素超标会影响人的中枢神经系统[6]，铅(Pb)元素对造血系统、神经系统、内分泌系统及免疫系统等均具有危害作用[6]，故中药材重金属残留问题是确保中药材“安全、可控、有效”的首要问题之一。丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)作为自然界中分布最广的植物共生真菌，外源接种AMF可有效地降低宿主植物对重金属元素的吸收[1,7-9]，如Li等[9]以翅荚木为宿主植物，外源接种AMF能与翅荚木形成良好的共生关系，降低翅荚木内Cu和Pd浓度；Wei等[1]以木香为宿主植物，发现外源接种摩西球囊霉(Glomusmosseae，Gm)、透明盾巨孢囊霉(Scutellosporapellucida，Spe)和美丽盾巨孢囊霉(Scutellosporacalospora，Sca)三种AMF可以显著降低木香根部对重金属元素(Cd、Cu、Hg、Pb和As)的吸收；Li等[10]以花生为宿主植物，外源接种AMF降低了植株地上部分Cd含量，改变了根系的形态结构来吸附固持Cd。可见，AMF可以通过根外菌丝螯合重金属离子和过滤保护根系等直接作用，以及促进宿主植物对营养元素的吸收改变根际土壤重金属生物有效性和根际环境等间接作用来减少宿主植物对重金属的吸收、转运和累积[11]，故外源接种AMF可有效地减少中药材重金属的残留，确保了中药材的安全性和有效性。

目前，对滇重楼重金属元素的研究主要集中于接种单株AMF[7,8]以及不同产地[11,12]等方面，而关于AMF混合菌剂对滇重楼根际土壤、须根和根茎内重金属元素的对比研究鲜有报道。故本研究对课题组前期筛选出的12种优良单株AMF[12-15]进行混合，对无菌盆栽的滇重楼进行接种共生培养。研究接种不同AMF混合菌剂对滇重楼根际土壤、须根和根茎内重金属残留量的影响，以便寻找出能有效降低滇重楼根际土壤、须根和根茎内重金属残留量的AMF混合菌剂，为不同AMF混合菌剂在滇重楼生产上的应用提供了理论依据，为滇重楼的菌根化栽培提供了技术支持。

1 材料和方法

1.1 供试丛枝菌根真菌

供试植株为滇重楼(Parispolyphyllavar.yunnanensis)实生苗，购买自云南省大理州农业科学推广研究院，经重庆三峡学院的周浓教授鉴定为百合科植物滇重楼。

根据课题组前期的试验结果[3,15]，按表1方式将12种优良单株AMF菌剂进行混合[16,17]，供试AMF购买自美国国际丛枝菌根真菌种质资源保藏中心，经三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室进行菌剂的保存和扩繁，接种菌剂为带有孢子、菌丝及侵染后根段的栽培基质。

表1 丛枝菌根真菌的混合方式

1.2 实验设计

供试土壤为未种植过滇重楼的沙壤土，基本理化性质如下：全钾28.83 g/kg、速效钾328.64 mg/kg、全氮1.83 g/kg、速效氮10.64 mg/kg、碱解氮为43.50 mg/kg、全磷0.315 g/kg、速效磷104.66 mg/kg、有机质21.2 g/kg、pH值6.87。供试土壤去除碎石、草根等杂物后，用2 mm筛子过筛，与河砂按3∶1体积比混合作为栽培基质，置于1×105 Pa、121 ℃高压灭菌锅内灭菌2 h，黑暗条件下保存1 周后装盆，栽培容器为15 cm×18 cm的白色塑料花盆(用75%乙醇溶液擦拭3遍)，每盆装土量为16.0 kg，按每千克土施用有机肥1.33 g、钾肥0.013 g、钙镁磷肥0.31 g充分混匀，作为基肥一次性施用。每盆栽种大小基本一致的滇重楼5株，温室光强设置为280 μmol/(m2·s)，光照时间为每天14 h，隔天浇水至田间持水量70%～80%。

本试验于2020年在重庆市万州区铁峰山国家森林公园室内进行，采用室温盆栽方法进行单因素随机区组设计，共设置9个混合菌剂处理(S1～S9)和1个对照(S10)，每处理各设置10次重复，每盆接种剂量为15 mL(每1 mL约含60个孢子)，菌剂均匀施在滇重楼根茎处的表土下，按照常规方式进行管理。

1.3 仪器与试剂

原子吸收分光光度计(TAS-990AFG，源于北京普析通用仪器有限责任公司)；原子荧光光度计(AFS-230E，源于北京科创海光有限公司)；数显加热板(C-MAG HP10，源于德国IKA集团)；电热恒温真空干燥箱(DZF-6050MBE，源于上海博讯实业有限公司)；分析天平(AE-240，源于梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；Pb、铜(Cu)、砷(As)、汞(Hg)和铬(Cr)空心阴极灯源于北京曙光明电子光源仪器有限公司。

重金属元素标准溶液(1000 μg/mL)：Pb(批号为GSB04-1742-2004)、Cu(批号为GSB04-1725-2004)、As(批号为GSB04-1714-2004)、Hg(批号为GSB04-1729-2004)和Cr(批号为GSB04-1723-2004)源于国家环境保护总局标准样品研究所，浓HNO3、氢氟酸和浓HCl均是优级纯，源于成都金山化学试剂有限公司，水为去离子水。实验所用玻璃器皿采用20% HNO3溶液浸泡24 h，去离子水冲洗干净，备用。

1.4 取样和测定方法

分别在2021年6月(T1)、7月(T2)、8月(T3)和9月(T4)收获滇重楼植株的须根、新根茎和老根茎，45 ℃条件下烘干，粉碎过40目筛备用；对应的根际土壤自然风干，按分析要求分别粗磨、细磨后过40目筛，备用。采用原子吸收光谱法测定根际土壤和根茎内Pb、Cu、As、Hg和Cr残留量[18]。

1.5 数据分析

试验数据的整理采用Excel 2003软件，数据方差分析采用SPSS 22.0统计(P<0.05)，绘图采用Origian 9.0软件进行。

根茎内重金属元素的富集系数(bioconcentration factor，BCF)按下列公式计算：

2 结果与分析

2.1 丛枝菌根真菌对滇重楼根际土壤内重金属元素残留量的影响

外源接种不同AMF混合菌剂对滇重楼根际土壤Pb、Cu、As、Hg和Cr 5种重金属残留量均有一定的影响(见图1)。与对照相比，滇重楼根际土壤重金属残留量在不同生长时期变化的差异较大，其中，S4处理对土壤中Pb残留量的调控效果最佳，S1、S3和S5处理的调控效果次之；S1处理对土壤中Cu残留量的调控效果最佳，S3和S9处理调控效果次之；S6处理对土壤中As、Hg和Cr残留量的调控效果最佳，其下降幅度依次为24.81%～75.43%、42.86%～75.54%和16.01%～83.96%，S4处理调控效果次之。

图1 丛枝菌根真菌对滇重楼根际土壤内重金属残留量的影响

从重金属残留量来看，Pb和Hg残留量随着生长时期延长先升高后降低，最高值出现在T2期；Cu和Cr残留量随着生长时期延长而逐渐增加，多数处理的最高值出现在T4期；而As残留量变化不明显，维持在1.96～8.68 mg/kg之间。中国土壤元素背景值规定Pb残留量为40.60 mg/kg、Cu残留量为46.30 mg/kg、As残留量为18.40 mg/kg、Hg残留量为0.065 mg/kg、Cr残留量为65.20 mg/kg[19]。除Cu和As外，其余3种元素均存在超过背景值的处理组。这说明AMF混合菌剂对重金属元素的吸收具有差异性和很强的生物吸附潜力，导致滇重楼根际土壤中的Pb、Hg和Cr元素存在不同程度的累积和富集。

2.2 丛枝菌根真菌对滇重楼须根内重金属元素残留量的影响

滇重楼须根中所含的药用成分与根茎具有相同性，所以进一步开发利用滇重楼须根资源具有重要的研究价值，滇重楼须根内5种重金属残留量高低顺序为As>Pb>Hg>Cu>Cr(见表2)，与对照相比，外源接种不同AMF混合菌剂可以不同程度地促进滇重楼须根内上述5种重金属残留量的增加，与对照相比，整个生育期内Pb残留量的平均增长幅度介于88.86%～156.97%之间，Cu残留量的平均增长幅度介于37.49%～88.97%之间，As残留量的平均增长幅度介于122.07%～138.79%之间，Hg残留量的平均增长幅度介于148.25%～169.69%之间，Cr残留量的平均增长幅度介于30.79%～50.02%之间，方差分析可知，除T1期S2处理和T2期S3处理的Pb、T3期S6和S9处理的Cr外，其余处理与对照间差异均达到了显著水平(P<0.05)。从重金属残留量来看，不同时期接种不同AMF混合菌剂后，滇重楼须根内重金属残留量普遍高于对照。其中，T3期S3处理的Pb残留量最高(0.59 mg/kg)，T1期S4处理的Cu残留量最高(0.29 mg/kg)，T1期S6处理的As残留量最高(1.83 mg/kg)，T4期S8处理的Hg残留量最高(0.17 mg/kg)，T2期S8和S9处理的Cr残留量最高(均为0.04 mg/kg)。

表2 丛枝菌根真菌对滇重楼须根内重金属残留量的影响

2.3 丛枝菌根真菌对滇重楼根茎内重金属元素残留量的影响

滇重楼新根茎和老根茎内重金属残留量高低顺序为Cr>As>Pb>Cu>Hg(见图2～4)，外源接种不同AMF混合菌剂对新根茎和老根茎内重金属残留量均有一定的影响，与对照相比，S6处理对新根茎和老根茎内Pb残留量的调控效果最佳，其下降幅度分别为7.53%～46.58%和11.95%～75.87%；S1和S6处理对新根茎内Cu残留量的调控效果最佳，S6和S7处理对老根茎内Cu残留量的调控效果最佳。其中，S6处理下降幅度分别为33.37%～77.51%和36.05%～68.59%；S4和S8处理对新根茎内As残留量的调控效果最佳，S3、S5、和S9处理对老根茎内As残留量的调控效果最佳；S1、S6和S9处理对新根茎内Hg残留量的调控效果最佳，S5、S6、S7和S8处理对老根茎内Hg残留量的调控效果最佳，其中，S6处理下降幅度分别为20.99%～45.43%和27.18%～61.89%；S2、S3和S6处理对新根茎内Cr残留量的调控效果最佳，S3、S4、S5和S6处理对老根茎内Cr残留量的调控效果最佳，其中，S6处理下降幅度分别为16.10%～42.03%和7.25%～78.69%。

图2 丛枝菌根真菌对滇重楼新根茎和老根茎内Pb和Cu残留量的影响

图3 丛枝菌根真菌对滇重楼新根茎和老根茎内As和Hg残留量的影响

图4 丛枝菌根真菌对滇重楼新根茎和老根茎内Cr残留量的影响

从重金属残留量来看，不同时期接种不同AMF混合菌剂后，滇重楼新根茎和老根茎内重金属残留量普遍低于对照。其中，T1期和T3期CK的老根茎内As残留量依次为2.03 mg/kg和3.93 mg/kg，T3期CK以及T4期S1、S2和CK的老根茎内Hg残留量依次为264.62、223.05、209.63和243.02 μg/kg，根据《中国药典》和《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》限量标准规定，上述处理的老根茎内As和Hg重金属残留量均不符合限量标准，除T3期S5处理的老根茎Cr残留量符合限量标准外，其余处理的Cr残留量均不符合限量标准，这可能与 AMF种间差异以及菌种间协同作用有关，不同菌种或不同AMF混合菌剂对重金属的敏感性不同，接种AMF混合菌剂促进了滇重楼对某种重金属的吸收，但无一致规律，具体原因有待进一步深入研究。

2.4 丛枝菌根真菌对滇重楼根茎内重金属富集系数的影响

滇重楼根茎内重金属富集系数可以反映宿主植物富集土壤重金属的能力，从表3的结果来看，Cr各处理的BCF均小于0.1，这说明滇重楼对Cr的吸收强烈贫化；Cu前期(T1和T2)各处理的BCF介于0.5～1.5之间，后期(T3和T4)各处理的BCF均小于0.5，这说明滇重楼对Cu的吸收随着生长时期的延长而逐渐贫化；As和Hg各处理的BCF均大于3.0，这说明滇重楼对As和Hg的吸收强烈富集。可见，滇重楼对重金属元素的吸收具有选择性，尤其是对As和Hg表现出强烈富集作用，对Cr表现出相对富集作用。

表3 丛枝菌根真菌对滇重楼根茎内重金属富集系数的影响

2.5 滇重楼根茎土壤中重金属间相关性分析

滇重楼种植基地土壤中的重金属元素间存在不同程度的相关性(见表4)，土壤中Pb残留量与Hg之间呈极显著正相关(R=0.629)，Cu残留量与Cr之间呈显著正相关(R=0.511)，这说明种植基地土壤中以上两种重金属元素之间存在相互促进吸收的关系；Cu残留量与Hg之间呈显著负相关(R=-0.335)。这说明种植基地土壤中Cu和Hg之间存在相互抑制吸收的关系。

表4 滇重楼根际土壤中重金属元素间相关分析

2.6 滇重楼根茎中重金属间相关性分析

重金属元素在滇重楼生长过程中的积累可能存在协同或竞争两种效应，不同生长时期表现出不同的变化规律(见表5)，就老根茎而言，Pb与Cu、As和Cr之间呈极显著正相关，其相关系数依次为0.527、0.753和0.414；Cu与Cr之间呈极显著正相关，其相关系数为0.455，As与Hg和Cr之间呈极显著正相关，其相关系数依次为0.487和0.500，Hg与Cr之间呈显著正相关，其相关系数为0.338，这说明滇重楼老根茎对重金属元素的吸收具有显著的协同作用。就新根茎而言，Pb与Cr之间呈极显著正相关，其相关系数为0.482，As与Hg之间呈极显著正相关，其相关系数为0.542，这说明滇重楼新根茎对Pb与Cr、As与Hg的吸收具有显著的协同作用；As与Cr之间呈极显著负相关，其相关系数为-0.484，Hg与Cr之间呈显著负相关，其相关系数为-0.369，这说明滇重楼新根茎对As与Cr、Hg与Cr的吸收具有显著的竞争作用。总之，滇重楼老根茎对重金属元素的吸收作用明显高于新根茎。

表5 滇重楼根茎中重金属元素间相关分析

3 讨论与结论

3.1 丛枝菌根真菌对滇重楼根际土壤中重金属残留量的影响

菌根真菌可以通过双向养分循环来促进药用植物的生长发育，提高药用植物的适应性，菌根植物可以将叶片中合成的有机物通过AMF大量地输送到根系中，同时根际土壤中的矿质元素(重金属)也可以通过AMF输入到植物组织中，以此来调控植物组织内矿质元素(重金属)含量[8,20]，故外源接种AMF是降低中药材重金属残留量的主要微生物修复有效策略之一[21]。本研究发现，接种AMF混合菌剂可以不同程度地减少根际土壤中重金属的残留量，其中，S4处理对土壤中Pb残留量的调控效果最佳，S1处理对土壤中Cu残留量的调控效果最佳，S6处理对土壤中As、Hg和Cr残留量的调控效果最佳，这说明AMF菌丝体对重金属的吸附潜力不同，并且不同真菌菌丝体对各金属离子的吸附能力也不同，其不同原因主要是不同AMF分泌的蛋白质、氨基酸、有机酸等有机物不同，这些分泌的有机物能够与不同的重金属离子螯合，进而降低根际土壤中重金属的生物可利用性或可移动性，从而减轻重金属的毒害。再者，从重金属残留量来看，滇重楼根际土壤中Pb、Hg和Cr的残留量超过中国土壤元素背景值，这说明AMF混合菌剂对滇重楼根际土壤中重金属元素的吸收具有差异性和很强的生物吸附潜力，导致菌根化的滇重楼根际土壤中Pb、Hg和Cr元素存在不同程度的累积和富集。

3.2 丛枝菌根真菌对滇重楼须根和根茎中重金属残留量的影响

植物对重金属的积累和忍耐是一个复杂过程，不同植物往往利用不同的适应机制来积累或者排斥重金属，进而维持自身的生长发育[11]，而外源接种AMF可以有效地减轻或避免中药材中重金属的残留已是不争的事实[1,9,10,22]。本研究发现，外源接种AMF混合菌剂可以不同程度地促进滇重楼须根内重金属残留量的增加，因为须根可与AMF首先建立良好的共生关系，形成菌根真菌，致使根外菌丝增加了根部与根际土壤直接的接触面积，加快了菌丝内聚磷酸盐与重金属的结合形成“过滤机制”，促进须根内重金属残留量的增加[22]。本研究发现，外源接种AMF可以显著降低滇重楼新根茎和老根茎内重金属的残留量，这与Zhang等[2]的研究结果相一致，根茎作为滇重楼的主要药用部位，其重金属主要来源于两个方面，一是来自根部的转移，二是根茎表面生长的部分须根所吸收的重金属部分沉积在根茎表皮，但在人工栽培过程中，药农主要的采收目标是主根，而导致大量的须根被遗留在土壤中；再者，新根茎和老根茎的整体代谢活动较慢，并且AMF可以直接通过螯合作用使重金属积聚于真菌中，故使滇重楼老根茎和新根茎内重金属残留量普遍低于对照。从滇重楼根部重金属残留量来看，滇重楼须根内重金属残留量顺序为As>Pb>Hg>Cu>Cr，滇重楼新根茎和老根茎内重金属残留量顺序为Cr>As>Pb>Cu>Hg，可见，同一植物不同器官对重金属的吸收能力不同。参照《中国药典》和《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》限量标准规定，本研究中所有处理的老根茎内As和Hg重金属残留量均不符合限量标准，除T3期S5处理的老根茎Cr残留量符合限量标准外，其余处理的Cr残留量均不符合限量标准，这可能与AMF种间差异以及菌种间协同作用有关，不同菌种或不同混合菌剂对重金属的敏感性不同，接种AMF促进了滇重楼对某种重金属的吸收，但无一致规律，具体原因有待进一步深入研究。

3.3 丛枝菌根真菌对滇重楼根茎中重金属富集系数的影响

重金属富集系数是描述重金属在生物体内累积趋势的重要指标，表明了重金属在植物体内的富集情况。野菊花对Cd的富集作用较强，富集系数为2.72，故野菊花栽培过程中需要注意土壤及环境中Cd的残留量，避免野菊花对Cd的过度富集导致药材中Cd超标[23]。本研究发现，滇重楼对As和Hg的BCF均大于3.0，这说明滇重楼对As和Hg的富集作用较强，人工栽培滇重楼过程中根际土壤易出现Hg和Cr累积和富集的情况，致使部分滇重楼根茎中Hg和Cr残留量出现超标情况，所以在滇重楼中药材生产质量管理规范(GAP)基地建设中应严格控制其栽培土壤性质，选择合适的AMF菌株进行混合，这为构建高效优质的滇重楼种植体系提供了一条新的技术途径。

综上所述，近明球囊霉、沙荒球囊霉、透明盾巨孢囊霉、美丽盾巨孢囊霉、巨大巨孢囊霉和球状巨孢囊霉6种单株AMF配制成的混合菌剂(S6)对滇重楼根际土壤、须根及根茎内重金属残留量的调控效果最佳。而AMF对重金属的吸附作用往往受诸多因素的影响(如宿主植物的种类、土壤肥力、土壤pH等)，再者不同真菌在菌丝生长、侵染能力及磷运输效率方面也存在差异，所以在生产实践中应用AMF时要考虑到这些方面。