加减知柏地黄丸治疗女童中枢性性早熟的疗效与雌激素受体基因多态性的关系

张国强 张文金 李金柳 陈凤媚 张畅斌 郑淑华 刘嘉芬 吕栩再 卢雪银

1广东省妇幼保健院（广州 511442）；2广州中医药大学（广州 510006）

性早熟（precocious puberty）是指男童在9 岁前、女童在8 岁前呈现第二性征［1］。儿童性早熟的总发病率估计为1∶5 000 至1∶10 000［2］，其中我国女童发病率约为男童的4.5 倍［3］，已成为社会日益关注的问题。《中西医结合儿科学》根据发病机理和临床表现，将性早熟分为中枢性性早熟（termed central precocious puberty，CPP）、外周性性早熟（idiopathic CPP，ICPP）和部分性早熟（peripheral precociouspuberty，PPP）［4］，其中中枢性性早熟约占女孩性早熟的80%。三种类型的发生都与雌激素水平的增加有关［5］，在体内，雌激素的作用由雌激素受体介导［6］。雌激素受体（estrogenreceptor，ER）包括ERα、ERβ 两种亚型，ERα 是位于6q25 染色体上的ERα 基因编码，而ERβ 是14q23-24 染色体上的ERβ 基因编码。雌激素受体（ER）基因序列分析发现，ERα 和ERβ 基因中存在相当数量的等位基因单核苷多态性，其中ERα 基因第1 内含子Xba Ⅰ（rs2234693）和Pvu Ⅱ（rs9340799）以及ERβ基因第5 外显子RsaI（rs1256049）和第8 外显子AluI（rs4986938）酶切位点都是当前研究热点［7-8］。多数研究证明，ERα 基因多态性与女童性早熟的发生存在联系，但结果存在争议［9-10］；而关于ERβ基因多态性与女童性早熟相关研究仍较缺乏［9，11］。

服用中药知柏地黄丸治疗女童性早熟早有报道，现有研究已证实其有效性［12-14］。其中，女童CPP 中医辨证以阴虚火旺型最多，多采用加减知柏地黄丸进行治疗，取得了明显的效果［1］。但是，目前经过中医辨证施治的CPP 患者的治疗效果仍然存在差异，有部分患者疗效不佳或没有效果。其原因很可能与机体基因多态性和遗传背景的差异有关，但目前关于加减知柏地黄丸治疗女童性早熟的疗效与ER 基因多态性的关系的研究十分缺乏。因此，本研究检测接受过中医治疗的CPP女童的ER 基因多态性，探讨雌激素受体基因多态性与中医治疗女童性早熟疗效的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2017年7月至2020年1月我院中医科门诊治疗的中枢性性早熟女童（除性早熟外无其他疾病）80 例纳入研究，采用加减知柏地黄丸治疗，在治疗6 个月后进行疗效评价。根据疗效将患者分为有效组（治疗显效与有效）60 例和无效组（治疗无效），20 例，对所有病例进行雌激素受体基因多态性检测。所有患者年龄7～10 岁；有效组平均年龄（8.83±1.75）岁，病程（6.25±1.42）个月；无效组平均年龄（8.92 ± 1.58）岁，病程（6.17 ±1.68）个月。两组患儿的年龄、病程、中医证型差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。本研究经广东省妇幼保健院医学伦理委员会审查通过（编号：广东省妇幼保健院医伦第［201601036］号），所有参与研究患者均知情同意。

表1 两组一般资料比较Tab.1 Comparison of general data between the two groups ±s

表1 两组一般资料比较Tab.1 Comparison of general data between the two groups ±s

组别有效组无效组χ2/t 值P 值中医证型（例）阴虚火旺证例数60 20年龄（岁）8.83±1.75 8.92±1.58 0.204＞0.05病程（月）6.25±1.42 6.17±1.68 0.208＞0.05 6 1肝郁气滞证40 10脾虚痰湿证14 9 3.403 0.182

1.2 病例纳入标准根据2010年《性早熟诊疗指南（试行）》中关于中枢性性早熟的诊断标准并按研究要求制定，并同时具备以下条件：（1）确诊为特发性中枢性性早熟（发病年龄≤8 岁）；（2）既往未接受过任何西药或中药治疗；（3）无中枢神经系统器质性病变，如下丘脑、垂体肿瘤或其他中枢神经系统病变。

1.3 治疗方法中医根据患儿体质采用加减知柏地黄丸治疗。方药为：生地黄15 g，泽泻10 g，牡丹皮10 g，山茱萸10 g，山药15 g，茯苓15 g，知母10 g，黄柏10 g，甘草6 g。每日一剂，水煎服，连续服药半年。对入选病例按《小儿中医体质及健康状况自填式问卷》进行体质辨识，分为三个证型：阴虚火旺证、肝郁气滞证、脾虚痰湿证。阴虚火旺证加鳖甲10 g，肝郁气滞证则加柴胡8 g、郁金10 g、白芍10 g，脾虚痰湿证则加陈皮5 g、砂仁5 g、白术10 g等，如乳房硬结明显则加浙贝母10 g、橘核6 g。

1.4 疗效评定根据《中药新药临床研究指导原则》评分标准，自拟“中枢性性早熟分级量化表”，显效：乳房缩小至青春前期，阴道分泌物消失，中医证候学评分减少≥70%，卵泡直径恢复正常，子宫和卵巢容积明显缩小，骨龄增长低于年龄增长；有效：乳房明显缩小，由Ⅲ期缩小至Ⅱ期或由Ⅳ期缩小至Ⅲ期，阴道分泌物减少或消失，中医证候学评分减少≥50%，卵泡直径、子宫和卵巢容积缩小，骨龄增长等同年龄增长；无效：乳房继续发育，以上观察指标无改善。

1.5 基因多态性检测

1.5.1 全血基因组DNA 抽提取抗凝血2 mL，按promegaA1120 说明书操作，抽取全血基因组DNA模板，-20 ℃保存备用。用超微量分光光度计测定各样本浓度OD260/OD280 紫外线吸收值1.75～1.80。

1.5.2 ERα 基因多态性检测参考相关文献设计ERα 引物，上游引物：5'-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCACC-3'，下游引物：5'-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3'，由上海百赛生物技术有限公司合成。ERαPCR体系为25 μL，其中2*MasterMix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、Template 1 μL（20～100 ng）、灭菌蒸馏水9.5 μL，程序如下：预变性95 ℃3 min，94 ℃变性30 s，68 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共35 个循环，循环结束后再72 ℃延伸15 min。1 个包含PvuⅡ和XbaⅠ多态性的1.3 kb 的片段被扩增。扩增完后分别行ERα基因PvuⅡ位点和XbaⅠ位点多态性分析。

1.5.3 ERβ 基因多态性检测参考相关文献设计ERβ 引物，ERβ RsaI 上游引物：5'-TCTTGCTTTCCCCAGGCTTT-3'，ERβ RsaI 下游引物：5'-ACCTGTCCAGAACAAGATCT-3'；ERβ AluI 上游引物：5'-TTTTTGTCCCCATAGTAACA-3'，ERβ AluI 下游引物：5'-AATGAGGGACCACAGCA-3'，由上海百赛生物技术有限公司合成。ERβ RsaI PCR 体系为25 μL，其中2*MasterMix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、Template 1 μL（20～100 ng）、DMSO 0.5 μL、灭菌蒸馏水9 μL，程序如下：预变性95 ℃3 min，98 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，共35 个循环，循环结束后再72 ℃延伸15 min。ERβRsaI 扩增的片段为156 bp。ERβ AluI PCR 体系为25 μL，其中2×MasterMix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、Template 1 μL（20～100 ng）、DMSO 0.5 μL、灭菌蒸馏水9 μL，程序如下：预变性95 ℃3 min，98 ℃变性10 s，68 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共35 个循环，循环结束后再72 ℃延伸15 min。ERβ AluI 扩增的片段为307 bp。扩增完后分别行ERβ 基因RsaI 和AluI 位点多态性分析。

1.6 统计学方法应用R 软件对实验数据进行统计学分析。计量资料表示为均数±标准差，比较用两独立样本t检验；计数资料表示为例（%），比较用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ERα 基因酶切结果ERα-PvuⅡ位点酶切处理可分出3 种基因型，PvuⅡ基因型分别为PP、Pp和pp（PP 型：1 300 bp；Pp 型：1 300、850 和450 bp 三条带；pp 型：850 和450 bp 两条带），见图1。ERα-XbaI 位点酶切可分出3 种基因型，XbaⅠ的基因型分别为XX、Xx 和xx（XX 型：1 300 bp；Xx 型：1 300、910 和390 bp 三条带；xx 型：910 和390 bp 两条带），见图2。

图1 ERα-PvuⅡ酶切结果Fig.1 Enzyme digestion results of ERα-PvuⅡ

图2 ERα-XbaⅠ酶切结果Fig.2 Enzyme digestion results of ERα-XbaⅠ

2.2 ERβ 基因酶切结果Erβ RsaI 位点酶切处理可分出3 种基因型，RR 型：156 bp；Rr 型：156、125和31 bp 三条带；rr 型：125 和31 bp 两条带，见图3。Erβ AluⅠ位点酶切处理可分出3 种基因型，AA型：307 bp；Aa 型：307、240 和67 bp 三条带；aa 型：240 和67 bp 两条带，见图4。

图3 ERβ RsaⅠ基因酶切结果Fig.3 Enzyme digestion results of ERβ RsaⅠ

图4 ERβ AluⅠ基因酶切结果Fig.4 Enzyme digestion results of ERβ AluⅠ

2.3 性早熟女童治疗效果与ERα-PvuⅡ的基因多态性分析性早熟女童有效组与无效组ERα-PvuⅡ基因型频率分布与等位基因频率分布比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 性早熟女童治疗效果与ERα-PvuⅡ基因多态性分析Tab.2 Analysis of therapeutic effect of precocious puberty in girls and ERα-PvuⅡpolymorphism例（%）

2.4 性早熟女童治疗效果与ERα-XbaⅠ的基因多态性分析性早熟女童有效组与无效组ERα-XbaⅠ基因型频率分布与等位基因频率分布比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 性早熟女童治疗效果与ERα-XbaⅠ基因多态性分析Tab.3 Analysis of therapeutic effect of precocious puberty in girls and ERα-XbaⅠpolymorphism 例（%）

2.5 性早熟女童治疗效果与ERβ RsaⅠ的基因多态性分析性早熟女童有效组与无效组ERβ RsaⅠ基因型频率分布与等位基因频率分布比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 性早熟女童治疗效果与ERβ RsaⅠ基因多态性分析Tab.4 Analysis of therapeutic effect of precocious puberty in girls and ERβ RsaⅠpolymorphism 例（%）

2.6 性早熟女童治疗效果与ERβ AluⅠ的基因多态性分析性早熟女童有效组与无效组ERβ AluⅠ基因型频率分布与等位基因频率分布比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表5。

表5 性早熟女童治疗效果与ERβ AluⅠ基因多态性分析Tab.5 Analysis of therapeutic effect of precocious puberty in girls and ERβ AluⅠpolymorphism 例（%）

3 讨论

儿童性早熟发生率呈现上升趋势，儿童性征过早出现可导致其身体和心理发育障碍及引发各种社会问题，引发广泛关注［1］。西医主要采用促性腺激素释放激素类似物（GnRHa）进行治疗，这也是当前主要的治疗选择，但因其价格昂贵，一般家庭难以坚持。也有相关报道认为此类药物不良反应多，每日注射容易导致多种过敏反应发生［1，15］。相对而言，中药作为天然药物，从胃肠消化吸收，符合人的生理状态，具有价格便宜、药源充足和副作用小的优点。

中医认为性早熟主要病机为肾阴不足，水不涵木，肝郁化火，阴虚火旺，阴不潜阳，相火妄动，病位主要在肝、肾二脏，但“见肝之病，知肝传脾”，郁火化痰。徐雯等［16］利用加减知柏地黄丸治疗CPP，结果发现在消除患儿胃热炽盛、虚火上炎证候的同时，亦使提前出现的第二性征如增大的乳房明显回缩，并能降低患儿提前升高的血清生殖激素，控制骨龄的继续发育，使提前发育的卵巢和子宫有缩小的趋势，尤其对卵巢的影响更为明显。我院中医科根据患儿体质采用加减知柏地黄丸治疗女童性早熟，取得了不错效果，但治疗效果仍然存在差异，有部分患者疗效不佳。

本研究的结果显示，采用加减知柏地黄丸治疗女童性早熟，其疗效与ERα-PvuⅡ与ERα-XbaⅠ的基因多态性没有关系，而与ERβ RsaⅠ与ERβ AluⅠ的基因多态性有关，含RsaⅠR 基因位点与AluⅠa 基因位点性早熟女童的治疗效果明显优于不含上述等位基因的患者。现有研究［9］已证实雌激素与ER 在女童性早熟中的作用。中枢性性早熟主要是由于下丘脑一垂体一性腺轴的提前启动引起，雌激素是该轴的靶激素。雌激素的最终效应不仅取决于雌激素本身的分泌与代谢，还与ERα、ERβ 基因突变或多态性引起的ER 敏感性增高有关［17］。雌激素与子宫、卵巢的ER 形成复合物，从而使子宫、卵巢增大，雌激素水平到峰值引发青春期的来临，滋阴泻火中药可下调子宫、卵巢上ERmRNA 及蛋白表达起到治疗作用［18］，这是知柏地黄丸可能的作用机制。

李明珠等［19］研究认为，ERα 基因PvuⅡ基因型、XbaⅠ基因多态性与CPP 相关。柯江维等［20］研究结果显示，ERβ 基因的AluI 基因与性早熟差异无统计学意义，而RsaⅠ基因型与对照组相比差异有统计学意义。吴小华等［21］研究认为，雌激素受体α 基因XbaⅠ位点多态性与CPP 存在一定相关性，Xx 基因型最易患病，ERα 基因PvuⅡ位点多态性与CPP 的发生无明显关联。基因的多态性可能导致ER 的差异，影响ER 与热休克蛋白的结合、在转录过程中的作用及对GnRH 的敏感性，从而导致了知柏地黄丸在不同个体的疗效差异。这是本次研究结果的可能解释，同时也从生理、生化的角度证实了中医采用加减知柏地黄丸治疗女童CPP的疗效可能与ER 基因多态性有关的猜想。

本研究分析加减知柏地黄丸对女童性早熟的疗效与ER 基因多态性的关系，为个体化治疗女童CPP 提供了分子水平的实验基础和新的研究方向，同时也为进一步推广中医治疗提供了理论支持。本研究仍存在不足：一方面，研究对象数量较少，可能使结果出现偏差。但相对现有的性早熟相关研究，本研究样本量已多于多数研究。另一方面，本研究样本来自我院治疗的性早熟女童患者，大多数患者来自广东地区，研究结果具有一定的地域局限性。本研究中，ERα 基因多态性不影响治疗效果，但对于ERα 基因与ERβ 基因不同的多态性组合在治疗效果影响中是否会有差异，目前未看到相关文献报道，可在未来的研究中扩大标本量加以了解。本研究的资料显示不同中医证型性早熟女童的治疗效果没有差异，但与ER 基因多态性之间是否关系，需进一步研究。

本研究为加减知柏地黄丸治疗女童性早熟疗效与ER 基因多态性关系的探究提供了基础，并为中医治疗的推广提供了参考。为进一步验证加减知柏地黄丸疗效与基因多态性的关系，还需要前瞻性实验对大样本量、来自我国不同地区的性早熟女童进行研究。