PRDM1和GATA2基因mRNA作为活动性结核和潜伏感染鉴别诊断标志物的可能性研究

刘艳华 王若 杨秉芬 曹志红 翟斐 孙雯娜 苏瑾文 俞珊 程小星

解放军总医院第八医学中心结核病医学部1全军结核病防治重点实验室，结核病诊疗新技术北京市重点实验室，2结核科（北京 100091）

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）感染引发的慢性传染性疾病，严重威胁人类健康。2020年WHO全球结核病报告显示我国是30 个结核病高负担国家之一，结核病发病例数居全球第三位，结核病是我国需要重点防控的重大传染病［1］。

人类感染M.tb 后，多数呈现带菌生存状态，并不会发展为结核病，称为潜伏感染者（latent tuberculosis infection，LTBI）；约5%～10%的LTBI会继续发展为活动性结核病（active tuberculosis，ATB）。国内流行病学调查结果显示，基于γ-干扰素释放试验（IFN-gamma release assay，IGRA）得出的M.tb感染率大约在20%～30%之间，即全国约有3～4 亿人为M.tb 感染者［1］，数目庞大的无临床症状的LTBI 是ATB 的重要来源。此外，由于LTBI 的预防性治疗方案与ATB 的抗痨治疗方案显著不同。因此，如何实现LTBI 与ATB 的早期鉴别诊断至关重要。

常用的M.tb 感染诊断方法包括传统的结核菌素实验（TST）以及IGRAs，TST 方法容易受到卡介苗接种和非结核分枝杆菌的干扰，MTB 感染诊断不够明确，更无法区别LTBI 和ATB。新近推行的IGRAs 方法，虽然能够检测MTB 感染，但无法区分LTBI 和ATB。近年来虽然陆续出现了一些先进的基于核酸扩增的分子生物学检测技术（如XpertMTB/RIF assay），但由于受到仪器设备和诊断费用的限制，以及假阳性率偏高等问题，还无法全面推广。因此，现行的结核病诊断方法或辅助诊断手段都无法实现快速有效的LTBI 和ATB 鉴别诊断，使得临床上面临严重的治疗延误以及过度治疗等问题。基于上述现状，寻找新的TB 特异标志物，鉴别诊断LTBI 和ATB，已经成为结核病临床诊断中一项亟待解决的难题［1］。

我们前期的转录组测序实验发现ATB 和健康人外周血中PRDM1 和GATA2 基因mRNA 表达存在显著差异。PRDM1 是转录因子blimp-1 的编码基因，blimp-1 能调控包括B 细胞、T 细胞、树突细胞、巨噬细胞和NK 细胞在内的多种免疫细胞的发育和分化。PRDM1 的基因多态性与多种自身免疫疾病（如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎和炎症性肠病）和淋巴瘤的发生密切相关［2-4］。GATA2 是转录因子GATA2 的编码基因，GATA2 基因突变导致的GATA2 蛋白功能缺陷是造成MonoMAC 综合征、原发性淋巴水肿伴有骨髓异常增生综合征（emberger syndrome）、树突、单核和B/NK 淋巴细胞缺乏征（DCML）和家族聚集性骨髓增生异常综合症/急性淋巴细胞白血病（MDS/AML）的遗传原因［5-6］。

PRDM1和GATA2与结核病的关系鲜有报道［7］。为了进一步了解PRDM1 和GATA2 在ATB 中的表达情况，以及它们作为结核病诊断标志物的价值，本研究通过荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，qPCR）方法在新的受试者中检测这两个基因的mRNA 表达，并利用受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC）分析它们单独或者联合鉴别诊断ATB 和LTBI 的能力。

1 资料与方法

1.1 研究对象纳入的ATB 患者为2018年2-7月期间解放军总医院第八医学中心的住院患者，结核病的诊断依据为“肺结核诊断［8］”，包括临床表现、CT 检查、抗酸杆菌染色（AFB）、细菌培养和核酸检测等。ATB共计91例，男57例，女34例，平均年龄为48 岁（21～65 岁）。LTBI 和健康对照（healthy control，HC）为2018年3-6月期间解放军总医院第八医学中心的体检人员，两组受试者均没有结核病史和结核病临床表现，X 线检查正常，IGRA 阳性者为LTBI，IGRA 阴性者为HC。LTBI 共计31 例，男19 例，女12 例，平均年龄为46 岁（28～59 岁）。HC 共计31 例，男18 例，女13 例，平均年龄为38 岁（23～56 岁）。三组受试者的年龄和性别组成差异无统计学意义（P＞0.05）。纳入的研究对象均没有肝炎、艾滋病和自身免疫相关疾病。本研究通过解放军总医院第八医学中心伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集与处理抽取受试者外周血置于肝素抗凝管中，4～6 h 内用Ficoll 分离液（美国GE）分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），用RPMI-1640 培养液（美国Invitrogen）洗涤细胞2 遍，细胞沉淀用1 mL 的Trizol（美国Invitrogen）溶解，然后冻于-80 ℃中备用。

1.2.2 RNA 提取和cDNA 合成按以前的操作步骤提取细胞总RNA［9］，按TaKaRa 反转录试剂盒（大连宝生物）操作说明合成cDNA。

1.2.3 引物序列及qPCR 检测利用NCBI 网站Primerblast 进行引物设计，GATA2 的参照基因序列号为：NM_001145661，上游引物为“5'-CCTGGCGCACAACTACATGG-3'”，下游引物为“5'-ACATCTGGCCTCCGGTCA-3'”。PRDM1 的参照基因序列号为：NM_001198，上游引物为“5'-TTAAGCCCATCCCTGCCAAC-3'”，下游引物为“5'-GCTCGGTTGCTTTAGACTGC-3'”。选择GAPDH为内参基因，参照的基因序列号为：NM_002046，上游引物为“5'-TGTTGCCATCAATGACCCCT-3'”，下游引物为“5'-TCGCCCCACTTGATTTTGGA-3'”。用SYBR GreenⅠ试剂盒（美国KAPA）进行qPCR 检测，每个反应设2 个复孔。反应程序为：95 ℃3 min，1 个循环；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 个循环。另外设计溶解曲线程序进行引物特异性检验。PCR 反应在LightCycle®480Ⅱ（Roche）上进行。

1.3 统计学方法所有反应的Ct 值均为2 个复孔的平均值，PRDM1 或GATA2 基 因mRNA 的 表达=2-△Ct（PRDM1/GATA2-GAPDH），数值用（±s）表示。采用Graphpad 5.0 和SPSS 13.0 软件进行统计学分析。其中Mann-Whitney 或Kruskal-Wallis 用于2 组或3 组 数据的非参数检验，受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC）用于线下面积（area under curve，AUC）、诊断灵敏度和特异度分析，取约登指数最大对应的cut-off 值计算诊断的灵敏度和特异度。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PRDM1 和GATA2 的mRNA 在不同受试者中的表达分析3 组受试者PRDM1 和GATA2 的mRNA表达差异，结果显示ATB的PBMCs中PRDM1和GATA2 的mRNA 表达均显著低于LTBI 和HC（H=69.27，P＜0.000 1；H=37.97，P＜0.000 1）。随后按AFB 或细菌培养的结果将ATB 分为菌阳组和菌阴组，按结核发病部位将ATB分为肺结核和肺外结核，分析ATB 各组GATA2 和PRDM1 的mRNA 表达差异。统计学分析显示，菌阳组和菌阴组ATB、肺结核和肺外结核ATB 中GATA2 的mRNA 表达差异无统计学意义（U=1 149，P=0.418；U=1 363，P=0.313 3）。ATB各组中PRDM1的mRNA 在菌阳组和菌阴组ATB、肺结核和肺外结核的表达也近似（U=881.5，P=0.314 4；U=1 263，P=0.567 8）。见图1。

图1 PRDM1 和GATA2 的mRNA 表达Fig.1 The mRNA expression of PRDM1 and GATA2 gene

2.2 PRDM1 和GATA2 的mRNA 对ATB 和LTBI的鉴别诊断以LTBI 为对照，用ROC 分析了PRDM1 和GATA2 的mRNA 诊断性能。GATA2 的AUC 为0.806（95%CI：0.717～0.896），诊断灵敏度为82.35%（95%CI：73.55%～89.19%）和特异度为70.97%（95%CI：51.96%～85.78%）。PRDM1的AUC为0.8967（95%CI：0.840～0.953），诊断灵敏度为80.22%（95%CI：70.55%～87.84%）和特异度为87.1%（95%CI：70.17%～96.37%）。GATA2和PRDM1联合诊断的性能分析结果显示GATA2-PRDM1 的AUC 为0.935（95%CI：0.894～0.976），诊断的灵敏度为76.9%（95%CI：66.68%～84.84%），特异度为100%（95%CI：86.27%～100%）。见图2。

图2 PRDM1 和GATA2 的mRNA 单独和联合诊断ATB 和LTBI 的ROCFig.2 The ROC analysis of mRNA of PRDM1 and GATA2 alone and together distinguishing ATB from LTBI

3 讨论

本研究收集ATB、LTBI 和健康人三组受试者外周血，qPCR 检测前期筛选出的差异表达基因PRDM1 和GATA2 的表达，并分析它们作为诊断标志物的价值。结果证实ATB 外周血中PRDM1和GATA2 基因mRNA 显著低于LTBI 和健康人，PRDM1 和GATA2 联合起来能较好的鉴别诊断ATB 和LTBI，灵敏度和特异度分别达到76.9%和100%。本研究之所以纳入ATB、LTBI 和健康人三组受试者是因为它们分别代表了人类三种M.tb 感染状态，即感染后发病、感染后不发病和未感染。

不同的感染状态下，宿主抗M.tb 的免疫应答不同，表达的基因产物也不同，这是差异表达基因及其产物作为诊断标志物的理论基础。研究者通过转录组测序发现ATB 和LTBI 中存在多个差异基因，并将其作为潜在的诊断标志物［10-12］。近年来研究人员不断的寻找诊断效果更好的差异基因及其组合［13-23］。比如LAUX DA COSTA 等［13］发现GBP5、GZMA 和CD64 基 因组合能鉴别ATB 与LTBI，GLIDDON等［14］发现FCGR1A、ZNF296和C1QB基因组合能鉴别ATB 与LTBI。本研究发现，与基因组合相比，PRDM1 或GATA2 单一基因的诊断效能较低，PERUMAL 等［15］也证实GBP1 和IFIT3 单一的诊断效能低于双基因组合。

ATB 为全身性疾病，相比于肺结核，肺外结核的诊断更困难［24-25］，本研究ATB 中纳入了18 例肺外结核（约占纳入ATB 病例的1/5），统计学分析发现肺结核和肺外结核中PRDM1 和GATA2 的平均表达水平相似，提示这两个基因不仅可以用于肺结核的诊断也可以用于肺外结核的诊断。此外，菌阴结核病也是结核病诊断的难点，本研究按涂片镜检的结果将ATB 分为菌阴和菌阳两组，结果表明两组患者PRDM1 和GATA2 的表达水平没有差异，提示PRDM1 和GATA2 也可以用于菌阴结核病的诊断。

总之，本研究发现PRDM1 和GATA2 基因的mRNA 联合起来可以用于ATB 和LTBI 的鉴别诊断。但是本研究收集的各组样本数较少，PRDM1和GATA2 作为结核病诊断标志物的能力还需要在更大的样本中进行验证。此外PRDM1 和GATA2 联合诊断的灵敏度还有待提高，是否需要联合其他的基因（如CD64）还需要进一步的研究。