基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术检测支气管肺泡灌洗液对涂阴或无痰肺结核的诊断价值

侯婧 王华 刘盛盛

安徽省胸科医院结核科（合肥 230022）

肺结核（PTB）是威胁人类健康的世界性公共卫生问题［1］。我国2020年结核发病人数约84.2 万人，居全球第二，结核病负担较重［2］。传统的痰液抗酸染色能够快速诊断结核病，但其阳性率小于30%，且部分患者无痰或留取痰液标本不规范，也影响了诊断率。这部分无痰或涂片阴性（涂阴）的PTB 患者约占总数的70%，快速、准确的对其做出诊断，对降低病死率、改善预后、控制结核传播至关重要，是目前结核病防治的重要任务［3］。临床常用支气管肺泡灌洗液（BALF）检测以克服影响痰液标本采集的诸多影响因素，提高疾病诊断率［4］。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF MS）是一种新型细菌鉴定技术，其准确性高、操作便捷、成本低廉，近年来已逐渐应用于临床多种病原微生物的鉴定［5-7］。但该技术对涂阴或无痰PTB 的BALF 检测诊断价值研究尚未见报道。本研究运用MALDI-TOF MS 对安徽省胸科医院收治的87 例涂阴或无痰疑似PTB 患者BALF 进行检测，探究其诊断价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2020年1月至2021年12月安徽省胸科医院住院诊疗的87 例涂阴或无痰的疑似PTB 患者为研究对象。纳入标准：（1）胸部影像学检查疑似PTB；（2）痰抗酸染色至少连续3 次阴性或无痰；（3）无纤维支气管镜检查禁忌，且同意该检查；（4）同意BALF 送检MALDI-TOF MS、SAT-TB、Gene-Xpert 检测以及BD960 培养。所有患者均签署知情同意书。

1.2 诊断标准

1.2.1 涂阴或无痰肺结核诊断本研究中诊断标准参考《WS288-2017 肺结核诊断标准》［8］制定，3 次痰涂片阴性或无痰，胸部影像学符合PTB 改变，且符合下列条件之一：（1）有咳嗽、咳痰、咯血等结核可疑症状；（2）皮肤结核菌素试验阳性或强阳性，或γ-干扰素释放试验阳性，或结核抗体阳性；（3）经诊断性抗结核药物治疗且随访观察有效者。

1.2.2 其他肺部疾病的诊断参照第九版《内科学》中呼吸系统疾病章节［9］，临床诊断为其他肺部疾病者。

1.3 BALF 收集方法患者于我院内镜中心行气管镜检查采集BALF，应用奥林巴斯BF1T206 纤维支气管镜，在胸部CT 提示病灶相应的支气管肺段注入0.9%NaCl 10～20 mL进行灌洗，负压吸引回收BALF 至无菌瓶。送我院检验科行SAT-TB、Gene-Xpert 检测及BD960 培养，上海康黎公司行MALDITOF MS 检测。

1.4 BALF检验方法（1）MALDI-TOF MS：应用美国Agena 核酸质谱分析系统MassARRAY 进行检测，先对BALF 常规生物灭活，配置反应液5 μL，进行PCR 引物扩增，后去除脱氧核糖核苷三磷酸，再进行检测位点的单碱基延伸反应，经处理后检测。（2）SAT-TB：采用上海仁度生物科技有限公司试剂盒，提取约2 mL 标本经处理后超声破碎15 min，取标本于恒温荧光检测仪上检测。（3）Gene Xpert：设备和试剂盒由美国Cepheid 公司生产，标本经消化等处理，仪器自动进行过滤和洗涤，超声溶菌并释放出DNA 后与PCR 反应试剂混合并检测。（4）BD960：采用美国BD 公司BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养仪，标本处理后接种于分枝杆菌培养瓶中进行液体培养［10］。

1.5 统计学方法采用SPSS 13.0 统计软件对数据进行统计分析，一般资料比较采用χ2检验或Fisher 确切概率法。各检验方法的诊断效能，如敏感性等比较采用χ2检验及事后两两比较。运用Medcalc 19.0.4 绘制受试者工作特征（ROC）曲线，以曲线下面积（AUC）评估不同检测方法的诊断价值，并采用Delong 法进行比较。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料87 例疑似PTB 患者纳入研究。根据最终诊断，结核组共54 例，男27 例，女27 例，年龄16～72 岁。其他肺部疾病组共33 例，男19 例，女14 例，年龄22～74 岁。两组患者的性别、年龄、症状等一般资料见表1。

表1 87 例疑似肺结核患者的一般资料Tab.1 Profiles of 87 patients with suspected pulmonary tuberculosis例

2.2 4 种检测方法的诊断效能MALDI-TOF MS、SAT-TB、Gene-Xpert 及BD960 法诊断特异性均＞95.0%；敏感性分别为68.5%（37/54）、13.0%（7/54）、40.7%（22/54）和27.8%（15/54）；阳性预测值分别为97.4%（32/33）、87.5%（7/8）、100.0%（22/22）和100.0%（15/15）；阴性预测值分别为65.3%（32/49）、40.5%（32/79）、50.8%（33/65）和45.8%（33/72）。4 种检测方法的敏感性差异有统计学意义（χ2=38.459，P＜0.001），两两比较发现MALDI-TOF MS 诊断的敏感性优于SAT-TB、Gene-Xpert 和BD960 法（P＜0.05）。见表2。

表2 4 种检测方法对涂阴或无痰肺结核的诊断效能Tab.2 The diagnostic efficacy of four testing methods for smear-negative or sputum-scarce pulmonary tuberculosis

2.3 4 种检测结果ROC 曲线分析进一步采用ROC 曲线对各检测方法的诊断效能进行评价。MALDI-TOF MS、SAT-TB、Gene-Xpert 及BD960 法的AUC值分别为0.827、0.550、0.704和0.639。MALDI-TOF MS 法的AUC 值最高，明显优于其他3 种检测方法（Z=8.139、3.608 和5.097，均P＜0.01），见图1。

图1 4 种检测方法ROC 曲线分析Fig.1 ROC curves of four testing methods

2.4 MALDI-TOF MS 法与其他方法的联合诊断效能MALDI-TOF MS 法分别与SAT-TB 法、Gene-Xpert 法和BD960 法联合诊断的AUC 为0.836、0.834 和0.832。联合诊断方法与单一MALDI-TOF MS法AUC的差异均无统计学意义（Z=0.993、0.987和0.976，P=0.32、0.32和0.33），见图2。

图2 MALDI-TOF MS 法与其他方法的联合诊断的ROC曲线分析Fig.2 ROC curves of joint diagnosis by combining MALDITOF MS with other methods

3 讨论

目前临床上对涂阴或无痰PTB 缺少快速、简便、有效的检测方法。分枝杆菌培养是其诊断的“金标准”，但耗时2～6 周，且受接种技术、培养基质量、孵化时间等多因素影响，不能满足临床早期、高效诊断的需求［11］。近年来分子检测技术逐步应用于PTB 诊断，提高了早期诊断率［12］。常见方法包括RNA 恒温扩增实时荧光检测（SAT-TB）、结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测（Gene-xpert），但其对于涂阴结核的诊断率仍较低，且操作繁琐、实验室要求高，难以满足临床需求［13-14］。

MALDI-TOF MS 是一种新型软电离生物质谱，其原理是在基质辅助下使结合后的分子发生电离，在电场作用下加速通过飞行管道，根据到达检测器的时间不同进行鉴别。从激光发射到信号检测的过程只需几毫秒，故可在不到50 min 的时间内对384 个样本进行分析。这种对复杂生物样本中的痕量核酸进行的检测，具有通量高、速度快、成本低的特点［15］。美国Agena Bioscience 公司MassARRAY@MALDI-TOF MS 于2018年被批准用于临床核酸检测，其不依赖于荧光探针和荧光类试剂的检测流程，克服了PCR 技术多重扩增能力不足的问题，解决了基因组检测中多个变异位点同时检测的需求［16］，且检测周期远低于传统的一代、二代测序（≥18 h），对少量标本也能够进行多基因多位点的检测［17-19］，满足了临床检测的需求。

已有不少研究证实该技术检测结核菌的准确性：CAO等［20］对国内外19项MALDI-TOF MS分枝杆菌鉴定研究进行Meta分析，涉及2 593株分离株，发现MALDI-TOF MS 鉴定结核菌的符合率为92%。有研究比较了MALDI-TOF MS、核酸杂交和MTB64免疫分析试验鉴定结核菌和非结核分枝杆菌的效果，MALDI-TOF MS 鉴定的符合率为88%，且鉴定时间仅需45 min，而核酸杂交需要6～7 h［21］。LUO等［22］的研究中，MALDI-TOF-MS 对507 株分枝杆菌分离株进行鉴定，正确率达到93.9%。但该技术检测涂阴或无痰PTB 患者BALF 标本的临床研究未见报道。临床工作中许多疑似肺结核患者，反复查痰涂片阴性，或在医师指导下仍无法留取合格的痰液标本，故本研究采用BALF 为研究标本，分别进行MALDI-TOF MS、SAT-TB、Gene-Xpert 检测以及BD960 培养。结果发现，以临床诊断为标准，以上各方法均具有极佳的诊断特异性。MALDITOF MS敏感性为68.5%（37/54），明显高于SAT-TB、Gene-Xpert 及BD960 的13.0%（7/54）、40.7%（22/54）及27.8%（15/54）。考虑其利用了多重PCR 技术，在同一个反应中可同时检测高达40个变异位点，且基于分子量的质谱检测方式提供了不依赖于荧光信号的检测准确度，大大提高了检测效能。

本研究中仍有31.5%的患者核酸质谱检测为阴性，考虑可能是：（1）BALF 中的结核菌量过少，经扩增后仍无法达到检测所需量；（2）其检测敏感度标准菌株质谱图库尚不能覆盖所有分枝杆菌。以上原因可能导致了MALDI-TOF MS的检测结果与临床诊断不一致。通过多次灌洗提高BALF 菌量，或自建临床菌株质谱图库，增加质谱图库范围，可进一步提高MALDI-TOF MS 的菌种鉴定能力。而在33 例非结核患者中仅有1 例MALDI-TOF MS 阳性，经临床分析考虑为假阳性，其特异性为97.0%，提示该方法诊断PTB 具有高度准确性。产生假阳性的可能原因分析如下：（1）在BALF 分装送检、支气管镜消毒或实验室操作过程中造成污染所致；（2）对近缘菌株的分辨率有限，偶有少量菌株被误判为结核分枝杆菌。提示在支气管镜消毒、BALF留取、标本分装及送检、实验室操作环节中应严格各项操作规范，避免人为因素而出现假阳性。

本研究中，MALDI-TOF MS、SAT-TB、Gene-Xpert和BD960 法的AUC 值分别为0.827、0.550、0.704 和0.639。其AUC 值优于其他3 种检测方法。进一步采用ROC 曲线分析了MALDI-TOF MS 分别联合其他3 种检测方法的诊断效能，发现MALDI-TOF MS单独诊断涂阴或无痰PTB 的AUC 和联合诊断的AUC 相比均无明显差异。这说明临床上可单独采用MALDI-TOF MS 法进行辅助诊断，避免联合多种检测手段带来的医疗资源消耗。

综上所述，MALDI-TOF MS 法对涂阴或无痰PTB 具有较好的辅助诊断价值和临床应用前景。本研究存在一定局限性，为单中心、小样本的研究，且样本量有限。今后可考虑多中心、大样本研究，以进一步验证其诊断价值。并扩大标本类型，如胸腔积液、脓液、脑脊液等，探索该技术对肺外结核的诊断价值。