含氨基酸或小肽的阳离子抗菌药物

王艳，吴条，唐美，邹俊娜（中南大学化学化工学院，长沙 410083）

念珠性阴道炎（vulvovaginal candidiasis，VVC）是女性最困扰的疾病之一，大约75%的女性一生至少患一次念珠性阴道炎。更糟糕的是，耐药菌株的出现会导致念珠性阴道炎治疗失败。实际上，耐药菌的出现和迅速传播已成为最大的公共卫生威胁之一，迫切需要研发不易诱导耐药菌产生的新抗菌药物。

人工设计合成的短脂肽（synthetic short lipopeptides，SSLP）[1-2]模拟天然抗菌肽（antimicrobial peptides，AMP）两亲性的结构特征，带有净正电荷和疏水团，保留了AMP的抗菌活性[3-5]，不同的是，SSLP的肽链很短，典型的SSLP肽链只有2～5个氨基酸残基，而且SSLP的疏水团是脂肪酸链部分，一般为10～18个碳原子，这不仅弥补了肽链短的问题，还提高了抗菌活性，同时SSLP的结构简单，可以实现工业化生产，克服了天然AMP来源有限和价格昂贵的问题，近年来获得大量关注。很多研究表明SSLP与AMP相似，主要通过破坏膜结构发挥杀菌作用，且抑菌活性依赖于正电荷数与碳链长度的平衡[6-8]。

阳离子表面活性剂（cationic surfactant，CS）具有SSLP相似的结构特征和抗菌活性，包括经典阳离子表面活性剂（classical cationic surfactant，CCS）（如苯扎溴铵、醋酸氯己定[9]）和氨基酸基阳离子表面活性剂（amino acid-based cationic surfactant，AACS）（如Nα-酰基精氨酸乙酯[10]）。AACS是SSLP的结构类似物，SSLP的肽链缩短到只有一个氨基酸就成为AACS，AACS的结构更加简单，合成更容易，更具优势。

本文研究的SSLP包括四种脂二肽[棕榈酰精氨酰精氨酰胺（C16-RR-NH2）、棕榈酰赖氨酰赖氨酰胺（C16-KK-NH2）、棕榈酰精氨酰赖氨酰胺（C16-RK-NH2）、棕榈酰赖氨酰精氨酰胺（C16-KR-NH2）]和一种脂五肽[葵酰精氨酰赖氨酰色氨酰色氨酰赖氨酰胺（C10-RKWWK-NH2）]，AACS包括六种不同碳氢链长的Nα-酰基精氨酸乙酯[Nα-癸酰精氨酸乙酯（C10-R-OEt）、Nα-月桂酰精氨酸乙酯（C12-R-OEt）、Nα-肉豆蔻酰精氨酸乙酯（C14-R-OEt）、Nα-棕榈酰精氨酸乙酯（C16-R-OEt）、Nα-硬脂酰精氨酸乙酯（C18-ROEt）、Nα-花生酰精氨酸乙酯（C20-R-OEt）]，作为对照的CCS包括苯扎溴铵和醋酸氯己定。

1 材料与方法

1.1 试药

L-精氨酸盐酸盐（阿拉丁生物科技），葵酰氯、月桂酰氯、肉豆蔻酰氯、棕榈酰氯、硬脂酰氯和花生酰氯（萨恩化学），其他用于合成Nα-酰基精氨酸乙酯的试剂都为分析纯，苯扎溴铵、醋酸氯己定（国药集团）。C10-RKWWK-NH2、C16-RR-NH2、C16-KK-NH2、C16-RK-NH2和 C16-KRNH2由合肥国肽生物技术公司定制合成。

1.2 Nα-酰基精氨酸乙酯的合成与表征

取10 mmolL-精氨酸盐酸盐加入500 mmol的乙醇中，冰浴搅拌0.5 h。使用恒压滴液漏斗缓慢滴加50 mmol二氯亚砜，待放热结束，常温搅拌12 h，旋干溶剂得精氨酸乙酯盐酸盐。

将制得的精氨酸乙酯盐酸盐溶解在适量乙醇中，滴加30 mmol三乙胺，冰浴搅拌1 h。将混合液平均分为6份，分别滴加适量的葵酰氯、月桂酰氯、肉豆蔻酰氯、棕榈酰氯、硬脂酰氯和花生酰氯，常温搅拌12 h，旋干溶剂，得到不同酰基链长度的Nα-酰基精氨酸乙酯粗品。

采用饱和碳酸氢钠洗涤-萃取-透析方法进行纯化，纯度经HPLC测定均大于95%，产率大于80%。1H NMR（布鲁克AVANCE Ⅲ，400 MHz，DMSO-d6）表征结果：

C10-R-OEt：δ4.19（dd，J＝13.0，8.6 Hz，1H），4.12～4.03（m，2H），3.08（s，2H），2.12（t，J＝7.3 Hz，2H），1.76～1.68（m，1H），1.65～1.55（m，1H），1.51～1.48（m，4H），1.24（s，12H），1.18（t，J＝7.1 Hz，3H），0.86（t，J＝6.5 Hz，3H）。

C12-R-OEt：δ4.18（dd，J＝13.0，8.4 Hz，1H），4.12～4.04（m，2H），3.08（s，2H），2.12（t，J＝7.3 Hz，2H），1.76～1.68（m，1H），1.63～1.58（m，1H），1.52～1.46（m，4H），1.24（s，16H），1.18（t，J＝7.1 Hz，3H），0.86（t，J＝6.4 Hz，3H）。

C14-R-OEt：δ4.16（dd，J＝12.2，7.7 Hz，1H），4.12～3.98（m，2H），3.11（s，2H），2.11（t，J＝7.2 Hz，2H），1.77～1.68（m，1H），1.63～1.54（m，1H），1.51～1.46（m，4H），1.24（s，20H），1.19（t，J＝7.3 Hz，3H），0.86（t，J＝6.2 Hz，3H）。

C16-R-OEt：δ4.17（dd，J＝12.6，7.6 Hz，1H），4.09～4.04（m，2H），3.09（s，2H），2.12（t，J＝7.4 Hz，2H），1.73～1.67（m，1H），1.63～1.59（m，1H），1.52～1.47（m，4H），1.23（s，24H），1.17（t，J＝7.2 Hz，3H），0.85（t，J＝6.4 Hz，3H）。

C18-R-OEt：δ4.18（dd，J＝12.9，7.8 Hz，1H），4.11～4.05（m，2H），3.10（s，2H），2.12（t，J＝7.2 Hz，2H），1.75～1.67（m，1H），1.65～1.57（m，1H），1.54～1.44（m，4H），1.24（s，28H），1.17（t，J＝7.0 Hz，3H），0.85（t，J＝6.2 Hz，3H）。

C20-R-OEt：δ4.19（dd，J＝12.7，7.6 Hz，1H），4.10～4.04（m，2H），3.07（s，2H），2.11（t，J＝7.2 Hz，2H），1.74～1.67（m，1H），1.63～1.56（m，1H），1.49～1.47（m，4H），1.23（s，32H），1.17（t，J＝7.1 Hz，3H），0.85（t，J＝6.1 Hz，3H）。

1.3 菌株、细胞和培养条件

大肠埃希菌（E.coli，ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（S.aureus，ATCC25923）、白假丝酵母菌（C.albicans，ATCC10231）、铜绿假单胞菌（P.aeruginos，ATCC27853）、耐甲氧西林金黄葡萄球菌（MRSA，ATCC43300）购自广东省微生物保藏中心，卷曲乳杆菌（L.crispatus，CGMCC1.2743）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株于－80℃保存在Microbank菌种保藏管中。C.albicans使用RPMI 1640培养基（3-吗啉丙磺酸缓冲液调节），E.coli、S.aureus、P.aeruginos和MRSA使用CAMHB肉汤培养基，L.crispatus使用MRS肉汤培养基，37℃恒温振荡培养箱中孵育16～24 h，其中L.crispatus置于无氧、含5%CO2的条件下孵育。人阴道上皮细胞株VK2/E6E7（上海栩冉生物科技有限公司）采用添加有10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基（含谷氨酰胺）。

1.4 抑菌活性、溶血活性、细胞毒性和诱导耐药实验

采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MMC），按美国临床实验室标准化协会推荐的用于抗微生物制剂的标准方案进行。杀菌动力学由时间杀菌实验测定[11]，使用新鲜无菌脱纤维羊血进行药物溶血活性实验[12]，药物对于人阴道上皮细胞株VK2/E6E7的毒性采用MTT法，按文献方法测定细胞死亡率[13]。

1.5 药物稳定性实验

采用加速实验法研究药物的稳定性，配制一系列不同pH值（pH 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）的C12-R-OEt水溶液（0.05%），每一种pH值的样品均分为两份，放入两个容器中密封，其中一个作为对照样，冷藏保存；另一个于95℃水浴中加热1 h，然后自然冷却至室温，与对照样一起进行HPLC检测，计算相对含量（C）。

采用t0.9法（药物分解10%的时间）测定药物的理论有效期[14]：5份C12-R-OEt水溶液（0.05%，pH 4.0的0.1 mol·L－1醋酸钠缓冲溶液）分别放在5个恒温水浴中加速分解，对照样冷藏保存，分别在两个时间点取样（60℃，2.5 h，3 h）、（65℃，2.0 h，2.5 h）、（70℃，1.5 h，2 h）、（75℃，1.0 h，1.5 h）、（80℃，0.5 h，1 h），观察产品外观，与对照样一起进行HPLC检测，计算相对含量（C）。以相对含量的对数（lgC）对时间t进行线性回归，通过不同温度T的拟合曲线，计算出各T的t0.9，再以各T的lgt0.9对（1/T）进行线性拟合，即可计算出任意温度下药物的理论有效期。

采用Agilent 1260高效液相色谱仪，Agilent SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色 谱 柱，流动相A为0.01%三氟乙酸水溶液，流动相B为0.01%三氟乙酸乙腈溶液，洗脱梯度（0～15 min，20%～85%B；15～17 min，85%B；17～20 min，85%～20%B），流速1.0 mL·min－1，检测波长215 nm，柱温30℃，进样量20 μL。

1.6 多次阴道刺激性实验

委托有资质的机构（苏州出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心）进行家兔多次阴道黏膜刺激实验，依据《消毒技术规范》（2002年版）[15]，受试物为C12-R-OEt水溶液（0.05%，pH 4.0，0.1 mol·L－1醋酸-醋酸钠缓冲溶液），对照组为0.9%氯化钠注射液，报告编号为HWY201800750。

2 结果与讨论

2.1 抗菌活性

2.1.1 抗菌敏感性实验 表1列出了本文研究的AACS、SSLP以及作为对照的CCS对三种标准菌株（革兰氏阴性菌E.coli、革兰氏阳性菌S.aureus和真菌C.albicans）的MIC和MMC，及对L.crispatus的MIC和MMC，并计算出选择性系数（SR），SR定义为L.crispatus和C.albicans MIC的比值（MICL.c./MICC.a.），SR越大意味着相对于阴道正常菌群，药物对于真菌有更好的选择性抑制作用。从表1可见，除了C20-R-OEt 对于真菌的MIC和MMC＞256 μg·mL－1之外，其他药物对于这三种标准菌株的MIC为4～256 μg·mL－1，MMC为1×MIC或者2×MIC，都显示出良好的杀菌活性。

表1 测试药物的抗菌活性和对真菌的选择性(μg·mL－1)Tab 1 Antimicrobial activity and fungal selectivity of the test drug (μg·mL－1)

具体来说，两种SSLP显示出中等的杀菌活性（脂二肽MIC在16～64 μg·mL－1，脂五肽MIC在8～32 μg·mL－1，SR＝8）。文献报道富含精氨酸（R）和色氨酸（W）的多肽和脂肽具有最高的抗菌活性，并推荐脂五肽C10-RKWWKNH2作为很有潜力的抗菌药物[7]。但是本研究表明，这种脂五肽并没有显示出比别的测试药物更好的抗菌活性和更高的真菌选择性。四种脂二肽（C16-RR-NH2、C16-KK-NH2、C16-RK-NH2和C16-KR-NH2）的MIC、MMC和SR都相差不大，说明精氨酸和赖氨酸的不同组合及顺序对抗菌活性没有什么影响。两种CCS（苯扎溴铵和醋酸氯己定）都有较好的抗菌能力（MIC在4～16 μg·mL－1，SR在8～16）。需要指出的是，Nα-酰基精氨酸乙酯抗菌活性随酰基的碳氢链长的增加表现出钟形曲线的变化趋势，与SSLP和CCS相较而言，C12-R-OEt和C14-R-OEt对于细菌（E.coli和S.aureus）具有更好的抗菌活性（MIC在8～16 μg·mL－1，SR＝16），C16-R-OEt和C18-R-OEt对于真菌C.albicans具有更好的抗菌活性（MIC＝4 μg·mL－1，SR＝16）。

2.1.2 杀菌动力学 从图1杀菌速度曲线可以得出测试药物完全杀灭三种标准菌株所需的最短时间。药物浓度对于细菌和真菌分别设置为1×MMC和2×MMC，在这些浓度下，100%菌株会在24 h内被完全杀灭，当作用时间限制在20 min时，测试药物表现出不同的杀菌动力学特征。C12-R-OEt 和C10-RKWWK-NH2有最快的杀菌速度，在2～10 min内杀灭了100%的E.coli（见图1A）和S.aureus（见图1B），C12-R-OEt 和 C14-R-OEt 杀真菌的速度最快，2 min内就杀灭了全部的C.albicans（见图1C）。其他测试药物的杀菌速度都要慢一些（有些数据没有显示在图1中）。图1的结果说明，从杀灭三种标准菌株的速度来看，C12-R-OEt性能最佳，C10-RKWWK-NH2次之。

图1 杀菌动力学Fig 1 Microbicidal kinetics

2.1.3 对于耐药菌株的抗菌活性P.aeruginosa是一种对于很多抗菌药物有天然耐药性的条件致病菌，MRSA不仅对于甲氧西林耐药，对于许多抗菌药物也耐药。表2是测试药物对于这两种耐药菌株的MIC和MMC。除了醋酸氯己定，其他的测试药物都能抑制和杀灭这两种耐药菌株（MIC在4～256 μg·mL－1，MMC在16～256 μg·mL－1），具体来说，P.aeruginosa能够被完全杀灭，虽然需要的药物质量浓度可能较高（MMC＝MIC在8～256 μg·mL－1），而在药物较低质量浓度时MRSA的生长和繁殖就受到抑制（MIC在4～8 μg·mL－1），当药物质量浓度增加，MRSA也会被完全杀灭（MMC在16～64 μg·mL－1），其中C10-RKWWK-NH2和C14-R-OEt对于这两种耐药菌株都表现出最强的杀菌活性。

表2 测试药物对耐药菌株的抗菌活性(μg·mL－1)Tab 2 Antimicrobial activity to resistant strains of the test drug(μg·mL－1)

2.2 溶血率和细胞毒性

表3列出了测试药物对于羊血的溶血活性以及对于人阴道上皮细胞株VK2/E6E7的细胞毒性实验结果。除C20-R-OEt（HC50＝128 μg·mL－1）外，不同酰基链长的Nα-酰基精氨酸乙酯的溶血活性没有太大差异（HC50＝30～48 μg·mL－1），而两种SSLP之间以及两种CCA之间则相差较大。细胞毒性方面，Nα-酰基精氨酸乙酯的细胞毒性随酰基的碳氢链长增加而增大（IC50从C12-R-OEt的66 μg·mL－1减 小 到C20-R-OEt的1.2 μg·mL－1）；两种SSLP疏水的碳氢链长不同，细胞毒性也是随着碳氢链长增加而增大；两种CCA细胞毒性都较大（IC50为6.5和7 μg·mL－1）。很明显，药物对于红细胞和人阴道上皮细胞的毒性不一样，用溶血活性来评估SSLP对于哺乳动物细胞的毒性[3，7，16]是不充分的，本文的结果说明，作为一种简化的体外药物安全性评估手段，细胞毒性实验不能仅用红细胞，还应该根据给药途径，使用相应组织细胞来进行。

表3中还列出了针对真菌C.albicans的治疗指数（HC50/MICC.a.和IC50/MICC.a），从这两个指标综合来看，最安全的药物是 C12-R-OEt（HC50/MICC.a.＝6，IC50/MICC.a.＝8.5），其他药物安全性都相对较差。值得指出的是，C10-RKWWKNH2和醋酸氯己定，从溶血活性的角度来看比较安全（HC50/MICC.a.在8～16），但是从对VK2/E6E7的细胞毒性角度来看，安全性较差（IC50/MICC.a在0.8～2.3）。

表3 测试药物对绵羊红细胞和人阴道上皮细胞株VK2/E6E7的细胞毒性(μg·mL－1)Tab 3 Toxicity to ovine erythrocytes and human vaginal epithelial cells VK2/E6E7 of the test drug (μg·mL－1)

2.3 诱导耐药菌产生情况

综合以上结果，我们选择抑菌活性和安全性都较好的C12-R-OEt继续进行研究，同时以C10-RKWWK-NH2和醋酸氯己定为对照，通过30 d连续给药，每日测定MIC（见图2）。从图2C可以 看 出，C12-R-OEt和C10-RKWWK-NH2对 于C.albicans的MIC变化很小，30 d内MIC只增加了一倍（C12-R-OEt的MIC从4 μg·mL－1变为8 μg·mL－1，C10-RKWWK-NH2的MIC从16 μg·mL－1变为32 μg·mL－1），而醋酸氯己定的MIC变化很大，30 d内MIC增加了7倍（MIC从8 μg·mL－1变 为64 μg·mL－1）。C12-R-OEt和C10-RKWWK-NH2对 于E.coli（见 图2A）和S.aureus（见图2B）的MIC呈现相同的变化趋势，说明同为氨基酸基阳离子两亲性化合物，不易诱导耐药菌产生。有研究认为带正电荷的AMP和SSLP通过静电作用力结合到带负电荷的微生物细胞膜上，导致膜结构破坏而死亡[1，17]，本研究推测C12-R-OEt具有同样的作用机制。虽然多黏菌素也有类似的机制，且近些年多黏菌素的耐药率有增加趋势，但是多黏菌素对革兰氏阴性细菌作用仍然颇强[18]，而从表1的结果来看，本文的测试药物对于革兰氏阳性菌和阴性菌的活性相当，说明包括C12-R-OEt在内的测试药物与多黏菌素的抗菌作用机制有所不同，具体作用机制有待研究。

需要指出的是，虽然醋酸氯己定对两种耐药菌株有很好的抗菌活性（MIC＝4～8 μg·mL－1，MMC＝8～32 μg·mL－1），但是考虑到其对人阴道上皮细胞株VK2/E6E7细胞毒性较大（IC50/MICC.a.＝0.8），且诱导耐药菌产生的倾向较大（见图2），不适合作为念珠性阴道炎外用治疗药物。

图2 诱导耐药试验Fig 2 Serial passage experiments for resistance induction

本文还做了交叉耐药实验，取醋酸氯己定连续给药30 d后，MIC已经增大7倍的菌株，转而给 药C12-R-OEt和C10-RKWWK-NH2，结果发现MIC与各自的初试值相同，说明对醋酸氯己定已经开始产生耐药的菌株，仍然对C12-R-OEt 和C10-RKWWK-NH2敏感，说明C12-R-OEt和C10-RKWWK-NH2的抑菌机制可能与CCS不同。

2.4 稳定性

加速实验法测定了不同pH条件下 C12-ROEt水溶液的稳定性，以C10-RKWWK-NH2为对照，95℃ 加热 1 h 后，C12-R-OEt含量随pH变化呈钟形变化趋势，pH较低或较高时（pH 1～2和pH 7～9），C12-R-OEt的含量显著降低（超过15%），当pH为3～6特别是pH为 3～4时，C12-R-OEt含量基本没有变化（回收率超过98%），C10-RKWWK-NH2水溶液比较稳定（pH 4时回收率为96%，pH 7时回收率为98%），并且水溶液的外观均无变化。然而当以固体形式于4℃储存12个月后，C12-R-OEt固体与初试状态无异，C10-RKWWK-NH2已经潮解，颜色也从白色变成棕黄色，说明C10-RKWWK-NH2稳定性较差。原因可能是其富含色氨酸，色氨酸是一种不稳定的氨基酸，在多肽链中容易分解着色，说明从化学稳定性角度，设计开发SSLP作为临床抗菌药物时应避免使用色氨酸，即便富含色氨酸的脂肽抗菌活性较好[7]。

通过以上加速实验法确定将C12-R-OEt配制成pH 4的水溶液使用（0.05%，0.1 mol·L－1醋酸-醋酸钠缓冲溶液），与阴道的pH环境基本一致。通过t0.9法预测其保质期，首先以相对含量的对数（lgC）对时间t进行线性回归，根据线性回归方程计算出各T的t0.9，结果见表4，以各T的lgt0.9对（1/T）进行线性拟合，得到：lgt0.9＝7185.1（1/T）－20.0（r2＝0.9923），据此计算出保质期约为1.5年（298 K），可见该溶液比较稳定，可以开发为临床使用的洗液。

表4 不同温度(T)时lg C 对时间(t)的线性回归方程及t0.9 Tab 4 Linear regression equation of lg C versus (t) at different temperatures (T) and t0.9

2.5 阴道黏膜刺激实验

根据以上研究结果，C12-R-OEt具有作为阴道抗菌洗液的潜力，故对其进行了多次家兔阴道黏膜刺激实验。实验组为C12-R-OEt水溶液（0.05%，pH 4.0，0.1 mol·L－1醋酸-醋酸钠缓冲溶液），对照组为0.9%氯化钠注射液。阴道解剖观察结果表明，实验组3只动物中有2只出现充血，1只出现水肿，对照组3只动物中1只出现充血，未见其他异常反应。根据组织学观察结果对阴道黏膜的刺激反应进行评分，实验组和对照组平均计分为7.33 和 6.56，据此计算出实验组的刺激指数为0.77，根据《消毒技术规范》[15]，刺激指数＜1为“无刺激性”，所以C12-R-OEt对家兔阴道黏膜刺激实验结果为无刺激性。

3 结论

三种氨基酸基阳离子表面活性剂（C12-ROEt，C14-R-OEt 和C16-R-OEt）、两种短脂肽（C10-RKWWK-NH2和C16-RK-NH2）和一种经典阳离子表面活性剂（醋酸氯己定）对于三种标准菌株（革兰氏阴性菌E.coli、革兰氏阳性菌S.aureus和真菌C.albicans）都有抗菌活性，对耐药菌株（P.aeruginosa和MRSA）也有很好的抑制作用；除了醋酸氯己定，都不易诱导耐药菌产生；C12-R-OEt具有最快的杀菌速度，C10-RKWWK-NH2次之。

短脂肽的溶血活性较小，但是对于人阴道上皮细胞株VK2/E6E7的毒性较大，所以短脂肽可以替代经典阳离子表面活性剂用于器械消毒，但是不适于作为念珠性阴道炎的候选药剂，提示在设计抗菌脂肽时要寻找新的疏水片段代替脂肪酸链，如具有疏水侧链的氨基酸。

C12-R-OEt结构简单，容易合成，对于念珠菌敏感，不易诱导耐药菌的产生，安全性高，稳定性好，对阴道黏膜无刺激性，最有潜力开发为念珠性阴道炎抗菌洗液。