熄风化湿方对腹泻型肠易激综合征大鼠的作用及其机制*

王克超，李珩

淄博市中心医院，山东 淄博 255036

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一种功能性胃肠疾病，其特征是肠排空改变、腹胀、腹痛及腹部不适，而无解剖或生化异常[1]。IBS主要分为腹泻型、便秘型和混合型三种主要类型[2]，腹泻型肠易激综合征(diarrheal irritable bowel syndrome，IBS-D)临床上常表现为与腹痛相关的腹泻，排便后腹痛可缓解，具有慢性和反复发作的特点[3]。IBS-D虽无明显致死率，但给患者带来严重的心理压力和经济负担，影响患者的正常生活[4]。目前，IBS-D的病理机制尚不完全清楚，常认为其与胃肠道菌群改变、传染性肠胃炎、内脏超敏反应、肠脑轴失调、慢性应激及遗传因素有关[5]，其中，内脏高敏感性是IBS-D发病的主要原因[6]。报道显示，IBS-D的发生机制与脑-肠轴功能紊乱密切相关，其中脑肠肽在IBS-D发病过程中起着重要的传递作用[7]。IBS-D患者结肠黏膜组织中存在一些轻、中度非特异性炎症改变，表明IBS-D可能与免疫功能紊乱密切相关[8]。迄今为止，临床上还没有用于治疗IBS-D的标准治疗剂，西医在治疗 IBS-D 中有一定的疗效，但其不良反应较多。目前，越来越多的中药配方用于临床治疗IBS-D[9-10]，中药熄风化湿方是南京中医药大学田耀洲教授的经验方，临床治疗IBS-D多年，具有清热化湿、柔肝熄风的功效，能显著改善患者的临床症状[11]。本研究探讨熄风化湿方对IBS-D内脏高敏感性大鼠生长激素释放肽(growth hormone releasing peptide，Ghrelin)、胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)及免疫功能的影响。

1 材料

1.1 实验动物40只SPF级雄性Wistar大鼠，体质量180～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证：SYXK(京)2018-0042，正常饲养1周以适应环境，第2周开始实验，饲养环境湿度70%，室温21 ℃，通风良好，12 h循环光照，本研究经淄博市中心医院伦理委员会批准(202207001)。

1.2 药物与试剂黄连、干姜、木香、黄芩、陈皮、生甘草、防风、钩藤、石榴皮、白术、白芍、白蒺藜、败酱草购自南京中医药大学附属中西医结合医院药房。Ghrelin、CCK、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-2 ELISA检测试剂盒(美国abcam公司，货号：ab263887、ab120209、ab197447、ab274400)；大鼠抗小鼠γδTCR抗体(美国SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司，货号：sc-100289 )；总蛋白提取试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司，货号：P1271-25)；BCA蛋白定量试剂盒(德国MERCK公司，货号：71285-M)；酪氨酸蛋白激酶(tyrosine-protein kinase，Jak)抗体、信号转导激活转录因子(signal transducer activated transcription factor，Stat)抗体(美国abcam公司，货号：ab125051、ab3987)。

1.3 仪器TG16G型台式高速离心机(常州市亿能仪器厂，离心半径：4 cm)；WMS-1037型生物显微镜、WMF-3590研究型荧光显微镜(上海无陌光学仪器有限公司)；DNM-9602型酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司)；Mini-PROTEAN Tetra型电泳槽(美国伯乐公司)；eBlotTML1型快速湿转仪(南京金斯瑞生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 熄风化湿方溶液的制备取黄连、干姜各3 g，木香、黄芩、陈皮、生甘草、防风各6 g，钩藤、石榴皮、白术各10 g，白芍、白蒺藜、败酱草各15 g，将上述药材粉碎，过40目筛，按质量体积比120加入水，煮沸提取30 min，提取3次，将提取液抽滤并浓缩，浓缩液放入80 ℃水浴中，进一步浓缩为终浓度为 1.0 g·mL-1的溶液。

2.2 动物分组、模型建立及药物干预从40只SPF级雄性Wistar大鼠中随机选取10只作为空白组，其余30只大鼠采用“母婴分离+乙酸刺激”法建立IBS-D大鼠模型[12]，具体操作如下：将经石蜡油润滑的直径为1 mm的输液导管插入大鼠肛内约2 cm，注入0.2 mL的0.5%乙酸，每天1次，随后每隔2 d增加0.1 mL，造模10 d后维持在0.5 mL，共处理14 d。粪便含水率≥30% 视为模型建立成功。将30只建模成功的IBS-D大鼠随机分成模型组、低剂量熄风化湿方组和高剂量熄风化湿方组，每组10只，低、高剂量熄风化湿方组大鼠分别以 10 mL·kg-1的体积灌胃给予10.9 g·kg-1、43.6 g·kg-1的熄风化湿方溶液，空白组和模型组大鼠灌胃给予等体积蒸馏水，每天1次，给药2周。

2.3 粪便含水率检测提尾刺激大鼠排便，收集大鼠粪便，用微量电子天平称其质量并记录数据后，烘箱干燥直至粪便质量不再变化，记录数据，计算粪便含水率。

粪便含水率=(鲜粪便质量-干粪便质量)/鲜粪便质量×100%

2.4 内脏敏感性检测通过检测大鼠腹部抬起和背部拱起所需注水量评价大鼠的内脏敏感性[13]。采用乙醚将大鼠麻醉后，络合碘消毒肛门，将石蜡润滑导尿管并插入大鼠肛门至气囊末端剩余1 cm时固定。大鼠苏醒后放入透明塑料笼内，向气囊内缓慢注水，持续观察大鼠腹部抬起和背部拱起20 s时的注水量并记录，所需注水量越少，提示大鼠内脏敏感性越高。实验重复3次取平均值。

2.5 大鼠结肠组织病理变化检测取结肠组织，多聚甲醛固定，包埋，切片，HE染色，二甲苯透明，干燥，封片，光学显微镜观察结肠组织病理变化。

2.6 血清脑肠肽及免疫功能指标的检测按350 mg·kg-1的剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉采血3 mL，离心取上清。ELISA法检测血清Ghrelin、CCK、IL-1β、IL-2的水平，操作步骤严格按照说明书进行。

2.7 免疫荧光染色检测大鼠肠黏膜γδT细胞给药结束后处死大鼠，取末端回肠组织，沿中线切开，采用载玻片刮取肠内组织，300目铜网过滤，然后制备成肠组织细胞悬液，2 000 r·min-1离心5 min，弃上清，获得细胞。加入10 mL的磷酸缓冲液，重悬细胞，然后加入10 mL淋巴细胞分离液，离心，获得白色分层，加入磷酸缓冲液15 mL，离心重复两次，采用磷酸缓冲液调整细胞浓度至1×106mL-1，取流式检测专用试管，每管加入100 μL，然后加入采用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的大鼠抗小鼠γδTCR抗体进行孵育，室温避光 20 min 后，2 000 r·min-1离心5 min，弃上清，磷酸缓冲液重悬，激光共聚焦扫描显微镜观察各组大鼠肠黏膜γδT细胞的荧光强度，评估细胞数量。

2.8 大鼠结肠组织Jak/Stat通路蛋白表达情况检测取结肠组织，制成匀浆，加入适量预冷RIPA裂解液充分混匀，冰上孵育1.5 h后，于4 ℃下 10 000 r·min-1离心10 min，取上清液，采用BCA蛋白检测试剂盒对各组细胞总蛋白进行定量后制样。凝胶电泳分离样品蛋白，转膜，截取目的条带浸于5%脱脂奶粉制成的封闭液中，置于摇床上室温封闭1 h。加封闭液稀释的Jak和Stat一抗(稀释比例为11 000)，充分摇匀后置于4 ℃环境下孵育过夜。洗膜，加入稀释比例为15 000的对应二抗，室温孵育2 h，洗膜后加入ECL化学发光液，避光反应 5 min，用定量成像仪收集结果。

2.9 统计学分析采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，并采用Graphpad5.01软件进行作图，组间两两比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 熄风化湿方对大鼠粪便含水率的影响与空白组比较，模型组大鼠粪便含水率显著升高(P<0.05)，且粪便含水率>30%，提示IBS-D大鼠模型制备成功。与模型组比较，低、高剂量熄风化湿方组大鼠粪便含水率明显降低(P<0.05)。见图1。

3.2 熄风化湿方对大鼠内脏敏感性的影响与空白组比较，模型组大鼠腹部抬起和背部拱起所需注水量明显降低(P<0.05)；与模型组比较，低、高剂量熄风化湿方组大鼠腹部抬起和背部拱起所需注水量明显升高(P<0.05)，提示熄风化湿方可降低 IBS-D 大鼠的内脏敏感性。见图2。

注：与空白组比校，*P<0.05；与模型组比校，#P<0.05图1 各组大鼠粪便含水率的比较

注：A：腹部抬起所需注水量比较；B：背部拱起所需注水量比较；与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05图2 熄风化湿方对大鼠内脏敏感性的影响

3.3 熄风化湿方对大鼠结肠组织病理变化的影响空白组结肠组织结构正常，黏膜完整，腺体排列规则，结构清晰，固有层可见黏膜肌层；模型组大鼠结肠组织固有层有明显中性粒细胞浸润，间质水肿严重，腺体排列紊乱，边界不清晰，黏膜下层可见血管增生；低、高剂量熄风化湿方组大鼠结肠组织的浸润和水肿情况显著改善，腺体增生愈合，排列整齐，结构清晰完整，未见明显的炎症细胞浸润。如图3。

3.4 熄风化湿方对大鼠血清Ghrelin、CCK水平的影响与空白组比较，模型组大鼠血清Ghrelin、CCK水平明显上升(P<0.05)；与模型组比较，低、高剂量熄风化湿方组大鼠血清Ghrelin、CCK水平显著下降(P<0.05)。见图4。

3.5 熄风化湿方对大鼠免疫功能的影响与空白组比较，模型组大鼠血清IL-1β水平显著上升(P<0.05)，IL-2水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，低、高剂量熄风化湿方组大鼠血清 IL-1β 水平显著降低(P<0.05)，IL-2水平显著上升(P<0.05)。见图5。

注：a：空白组；b：模型组；c：低剂量熄风化湿方组；d：高剂量熄风化湿方组图3 各组大鼠结肠组织HE染色结果(×200)

注：A：各组Ghrelin水平比较；B：各组CCK水平比较；与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05图4 各组大鼠血清脑肠肽Ghrelin、CCK水平的比较

注：A：各组IL-1β水平比较；B：各组IL-2水平比较；与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05图5 熄风化湿方对大鼠免疫功能的影响

3.6 熄风化湿方对大鼠肠黏膜γδT细胞的影响与空白组比较，模型组大鼠肠黏膜γδT细胞荧光强度显著升高(P<0.05)；与模型组比较，低、高剂量熄风化湿方组大鼠肠黏膜γδT细胞荧光强度显著降低(P<0.05)。提示熄风化湿方可明显降低 IBS-D 大鼠结肠黏膜γδT细胞的数量。见图6。

3.7 熄风化湿方对大鼠结肠组织中Jak/Stat通路蛋白表达变化的影响与空白组比较，模型组大鼠结肠组织Jak、Stat蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，低、高剂量熄风化湿方组大鼠结肠组织Jak、Stat蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见图7。

注：A：免疫荧光染色图(蓝色荧光：淋巴细胞；绿色荧光：γδT细胞；a：空白组；b：模型组；c：低剂量熄风化湿方组；d：高剂量熄风化湿方组)；B：黏膜γδT细胞荧光强度比较；与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05图6 各组大鼠肠黏膜γδT细胞数量的比较

注：A：Western Blot检测Jak、Stat蛋白表达图；B：Jak、Stat蛋白相对表达水平结果比较；与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05图7 各组大鼠结肠组织中Jak/Stat通路蛋白表达水平比较

4 讨论

我国IBS-D的患病率高达6.5%，且呈逐年上升趋势[14]。目前，西医主要采用调节肠道菌群、止泻、解痉等对症治疗方法治疗IBS，但并未取得满意的疗效[15]。研究表明，中医药在治疗IBS-D方面具有独特的优势，可明显改善肠道功能紊乱症状，降低复发率[16]。IBS-D在中医属于“泄泻、腹痛、郁症”等范畴，肝郁生风、风木乘脾、脾虚生湿为IBS-D的重要发病机制[11]。熄风化湿方是南京中医药大学田耀洲教授在临床实践及中医学理论的基础上创制的用于治疗IBS-D的中药配方，具有柔肝熄风、清热化湿的功效，可双向调节肠道活动，改善其电生理活动，降低内脏敏感性[17]。本研究成功制备了IBS-D大鼠模型并给予熄风化湿方治疗，结果发现，与模型组相比，熄风化湿方组大鼠的精神状态、活动、饮食等情况均明显好转，粪便含水率和内脏敏感性下降，血清脑肠肽、免疫功能指标得到改善，表明熄风化湿方对IBS-D大鼠具有较好的治疗作用。

Ghrelin由28个氨基酸组成，广泛分布于胃肠道器官，少量存在于下丘脑、弓状核、胎盘、肾脏等部位[18]，是体内促生长激素分泌素受体(growth hormone secretagogue receptor，GHS-R)的天然配体，刺激生长激素(growth hormone，GH)的分泌[19]，当Ghrelin与其受体结合后，能够加快胃排空和小肠传输速度[20]。CCK是促使胆囊收缩的物质，存在于十二指肠、大脑皮层、海马、杏仁核、下丘脑等部位[21]。CCK以多种激素形式存在于血浆和胃肠组织中，促进胃肠道平滑肌兴奋收缩，对胃肠道起到重要的调节作用；也可作用于中枢神经系统，起着神经递质的作用[22]。本研究发现，模型大鼠血清Ghrelin、CCK水平显著上升，表明IBS-D模型大鼠可能因大量分泌Ghrelin、CCK导致胃肠功能紊乱，出现腹泻等症状；给予熄风化湿方治疗后，血清Ghrelin、CCK水平显著下降，提示熄风化湿方对IBS-D大鼠血清脑肠肽水平具有调节作用。

临床研究发现，IBS-D患者结肠黏膜组织中存在一些轻、中度非特异性炎症，表明IBS-D的发生可能与免疫功能紊乱密切相关[23]。本研究发现，模型大鼠血清IL-1β水平明显升高，IL-2水平明显降低，表明IBS-D的发生与免疫功能紊乱有关；给予熄风化湿方治疗后，血清IL-1β水平显著下降，IL-2 水平显著上升，表明熄风化湿方对改善大鼠免疫功能有较好的疗效。γδT细胞是一类表型和功能独特的T淋巴细胞亚群，是连接天然免疫和固有免疫的桥梁，决定机体特异性免疫应答的类型，对维持黏膜免疫稳态具有重要的作用[24]。本研究发现，模型大鼠肠黏膜γδT细胞数量明显增加，而给予熄风化湿方治疗后，γδT细胞数量显著降低，表明熄风化湿方可有效调节IBS-D大鼠肠黏膜中γδT细胞的数量，调节免疫功能。Jak/Stat信号通路是由细胞因子刺激的信号转导通路，在机体细胞的增殖、分化、凋亡及免疫调节中发挥着重要的作用[25]。Jak/Stat信号通路与机体的炎症反应密切相关，可参与肠道炎症反应[26]。本研究发现，模型大鼠结肠组织Jak、Stat蛋白表达水平显著上升，经熄风化湿方治疗后，Jak、Stat蛋白表达水平显著下降，表明熄风化湿方可通过调控Jak/Stat信号通路调节大鼠的免疫炎症反应。

综上所述，熄风化湿方能有效改善IBS-D大鼠的症状，降低大鼠血清Ghrelin、CCK水平，改善免疫功能，其机制可能与Jak/Stat信号通路的调控有关。肠道神经系统和中枢神经系统协同完成肠道的神经支配和调节，大鼠血浆中的P物质及血管活性肠肽是中枢和肠道神经系统中普遍存在的肽类物质，与IBS-D的发生密切相关，本研究将进一步探究熄风化湿方对IBS-D大鼠血浆及组织中P物质和血管活性肠肽水平的影响，并探究其作用机制，进一步阐明熄风化湿方对IBS-D大鼠的治疗作用。