远志皂苷B对电离辐射损伤的保护作用及机制研究*

职小飞，徐萍，张克清，李相中

1.郑州大学第一附属医院附属安阳医院，河南 安阳 455003； 2.新乡医学院，河南 新乡 453003； 3.安阳市中医院，河南 安阳 455003

随着科学技术的发展，人们暴露于各类射线的概率日益增加，受到辐射的概率也大为增加，因此寻求有效地防治辐射的药物也日显重要[1]。电离辐射是最常见的辐射，可以引起头晕、乏力、食欲下降等免疫力低下的症状[2]。远志皂苷B为药材远志中的化合物，具有抗衰老、抗抑郁、镇静、祛痰镇咳、抗癌、抗诱变和增强免疫力等药理作用[3-6]。前期研究发现，远志皂苷B可以减轻电离辐射的损伤[7-8]，但其作用机制有待于进一步研究。为进一步探明远志皂苷B减轻电离辐射损伤的作用机理，本实验拟采用电离辐射损伤小鼠模型，通过观察胸腺组织中核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)抑制因子α (inhibitor of NF-κBα，IκBα)、p53、半胱氨酸蛋白酶-3 (caspase-3)的基因和蛋白表达水平，探究其减轻电离辐射损伤的作用机理。

1 材料

1.1 动物120只SPF级雄性BALB/c小鼠，8～12周龄，体质量为(25±2) g，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2015-0018。小鼠饲养房内恒温(23±2) ℃、恒湿(湿度50%)，光照时间为800—2000，且动物被允许自由摄食饮水。本研究所涉及的所有实验均按照中华人民共和国科技部发布的实验动物管理条例执行。

1.2 药物及试剂远志皂苷B(成都德思特生物技术有限公司，纯度98.9%，批号：DY0088)。Trizol、Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：15596018、4367659)；Takara逆转录试剂盒(大连Takara公司，批号：9767)；IκBα兔抗鼠抗体、p-IκBα兔抗鼠抗体、p53兔抗鼠抗体、caspase-3兔抗鼠抗体、GAPDH抗体(德国Merck公司，批号：P36896、P11021、P29147、P42574、P04406)；羊抗兔二抗(武汉博士德生物公司，批号：20180211)；引物合成由南京金斯瑞生物科技公司完成。

1.3 仪器Practum型电子天平(德国SARTORIUS公司)；XFA6100型血球仪(北京普朗新技术有限公司)；EnSight型多功能酶标仪(美国PERKINELMER公司)；QIAxcel Advanced型核酸蛋白分析仪(德国Qiagen公司)；MyCycler型PCR扩增仪、Gel Doc EZ型全自动免染凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)；Centrifuge 5418 R型离心机(Eppendorf公司，离心半径：76 mm)。

2 方法

2.1 动物分组、模型建立及给药适应性饲养1周后，将120只SPF级雄性BALB/c小鼠随机分为空白组、模型组、远志皂苷B低剂量组和远志皂苷B高剂量组，每组30只。除空白组外，其他组小鼠根据参考文献描述进行全身一次性5.5 Gy γ射线照射3 h建立电离辐射损伤模型[9]。造模完成的第2天开始给药，远志皂苷B低、高剂量组以10 mL·kg-1的体积分别灌胃给予10 mg·kg-1、20 mg·kg-1的远志皂苷B溶液，空白组和模型组灌胃给予等体积生理盐水，每天1次，持续给药4周。小鼠饲养期间，记录造模后及给药期间体质量的变化及动物死亡数和死亡时间，每7天称量1次小鼠的体质量。

2.2 小鼠外周血淋巴细胞计数和胸腺系数检测末次给药结束后24 h，称取体质量，摘眼球取血，使用血球仪计数外周血淋巴细胞数，并计算百分率。取血后颈部脱臼处死小鼠，取胸腺，分离脂肪和韧带，擦干血水，称取质量，计算胸腺系数。

胸腺系数=胸腺质量/体质量×100%

2.3 RT-PCR检测胸腺中IκBαmRNA、p53mRNA、caspase-3mRNA的表达摘眼球取血后，颈部脱臼处死小鼠，取胸腺。Trizol法提取胸腺总mRNA，提取后用核酸蛋白仪检测纯度，纯度为 1.8～2.2即合格；按照Takara逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA，按照Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒说明书操作完成后，置于PCR仪进行基因扩增，反应体系如下：SYBR Green PCR Master Mix 25 μL；上游引物1 μL；下游引物1 μL；dNTP 2 μL；cDNA模板2 μL；加入ddH2O使总体积达50 μL。反应条件如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 60 s，45个循环；72 ℃ 10 min。用2-△△Ct表示mRNA相对表达水平。使用Primer Premier 5 设计IκBα、p53、caspase-3及内参GAPDH引物，序列见表1。

2.4 Western Bolt检测胸腺内IκBα、p-IκBα、p53、caspase-3蛋白表达量取胸腺组织50 mg，加蛋白裂解液，研磨，12 000 r·min-1离心30 min，取上清，使用BCA法检测各组蛋白总量；加样后使用10%凝胶，80 V电泳至分离后转至120 V电泳至胶下缘，100 V 90 min转膜，5%脱脂奶封闭2 h；分别加入IκBα、p-IκBα、p53和caspase-3一抗(稀释比例为11 000)，置4 ℃冰箱过夜，洗膜，再加入二抗(稀释比例为15 000)，洗膜，11配置ECL工作液显影；置于凝胶图像成像分析系统，曝光蛋白条带，拍照并分析各组条带灰度值。

表1 引物序列

3 结果

3.1 各组小鼠体质量比较与空白组比较，第8天、第15天、第22天及第29天模型组小鼠体质量显著下降(P<0.01)。与模型组比较，第8天、第15天、第22天及第29天远志皂苷B各给药组小鼠体质量均显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠不同时期体质量变化比较

3.2 各组小鼠外周血淋巴细胞计数和胸腺系数比较与空白组比较，模型组小鼠外周血淋巴细胞数、淋巴细胞百分率和胸腺系数明显降低(P<0.01)。与模型组比较，远志皂苷B低剂量组小鼠外周血淋巴细胞数极显著性升高(P<0.01)，淋巴细胞百分率和胸腺系数显著升高(P<0.05)；远志皂苷B高剂量组小鼠外周血淋巴细胞数和胸腺系数显著升高(P<0.05)，淋巴细胞百分率极显著升高(P<0.01)。见表3。

表3 远志皂苷B对小鼠淋巴细胞数及百分率、胸腺系数的影响

3.3 各组小鼠4周内平均存活时间和生存率比较空白组小鼠4周内无死亡，平均存活时间为 30 d，生存率为100%；模型组小鼠从第5天开始死亡，30 d内死亡19只，平均存活时间为19.77 d，生存率为36.70%；远志皂苷B低剂量组小鼠从第7天开始死亡，30 d内死亡15只，平均存活时间为24.30 d，生存率为50%；远志皂苷B高剂量组小鼠从第8天开始死亡，30 d内死亡12只，平均存活时间为26.10 d，生存率为60%。与空白组比较，模型组小鼠平均存活时间和生存率均显著降低(P<0.01)。与模型组比较，远志皂苷B高剂量组的平均存活时间和生存率均显著增加(P<0.05)。见图1及表4。

表4 远志皂苷B对小鼠生存时间的影响

图1 各组小鼠4周生存率比较

3.4 RT-PCR检测结果比较与空白组比较，模型组小鼠胸腺中IκBαmRNA表达水平明显降低(P<0.01)，p53mRNA、caspase-3mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。与模型组比较，远志皂苷B低剂量组小鼠胸腺中IκBαmRNA表达水平显著上升(P<0.05)，p53mRNA、caspase-3mRNA表达水平极显著性下降(P<0.01)；远志皂苷B高剂量组小鼠胸腺中IκBαmRNA表达水平极显著性上升(P<0.01)，p53mRNA表达水平极显著性下降(P<0.01)，而caspase-3mRNA表达水平显著下降(P<0.05)。见表5。

表5 各组小鼠胸腺中IκBα、p-IκBα、p53、caspase-3的mRNA表达水平比较

3.5 Western bolt检测结果比较与空白组比较，模型组小鼠胸腺中IκBα蛋白表达水平明显降低(P<0.01)，而p-IκBα、p53、caspase-3蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。与模型组比较，远志皂苷B各剂量组小鼠胸腺中IκBα蛋白表达水平明显上升(P<0.05)，而p-IκBα、p53、caspase-3蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。见表6和图2。

表6 各组小鼠胸腺中IκBα、p-IκBα、p53、caspase-3蛋白表达水平比较

注：A：空白组；B：远志皂苷B高剂量组；C:远志皂苷B低剂量组；D:模型组图4 各组小鼠胸腺中IκBα、p-IκBα、p53、caspase-3蛋白条带图

4 讨论

中医认为，免疫力属于卫气范畴，而卫气源于肾阳，属阳，肾为先天之本，一身阴阳之根本，故肾阳为卫阳产生之根本，肾阳充足则卫阳充足。周学海在《读医随笔》中云：“卫气者，本于命门，达于三焦”[10-11]。中药远志味苦、辛，性温，归心、肺、肾经，具有安神益智、交通心肾、祛痰消肿等功效，临床可治疗失眠、健忘、咳嗽痰多、痈疽疮毒等。远志性温属阳，归肾经，温肾阳而增强卫气，具有提高免疫力的作用。远志皂苷B作为中药远志的主要有效成分，具有多种药理活性，其临床应用十分广泛，可用于治疗阿尔茨海默病、心脑血管疾病及癫痫等[12-13]；还可配茯神、龙齿等中药，以化痰湿健脾，交通心肾，安神助眠[14-15]。此外，也有研究报道，远志皂苷有抗炎、提高免疫功能的作用[16-17]，但其具体的机制仍需进一步探讨。

免疫功能低下是最常见的辐射损伤，患者常有乏力、倦怠、食欲低下、体质量下降、精神不佳等症状，实验室检查可发现，辐射损伤患者具有外周血淋巴细胞数、淋巴细胞百分率和胸腺系数较低的表现[18-19]。胸腺是机体调节免疫功能的重要免疫器官，但其对辐射敏感度高，常受辐射损伤[20-21]。淋巴细胞是机体内特异性免疫细胞，同样对辐射敏感[22-23]。辐射损伤后，淋巴细胞DNA合成障碍，从而引起淋巴细胞数量和百分率降低。本实验发现，远志皂苷B尤其是高剂量不仅可有效提高小鼠外周血淋巴细胞数、淋巴细胞百分率和胸腺系数，还可以延长小鼠4周内存活时间，提高4周生存率。提示远志皂苷B对辐射损伤小鼠具有免疫保护作用。

NF-κB是体内介导细胞增殖分化和诱导细胞凋亡的关键性转录因子[24]。正常情况下，NF-κB与IκB结合以无活性的二聚体滞留于细胞质内。淋巴细胞受损后，IκB发生磷酸化，与NF-κB解离，NF-κB解离后进入细胞核进而诱导淋巴细胞凋亡，而IκBα是IκB蛋白家族的主要成员，是 NF-κB 活化的敏感标志之一[25]。本实验发现，模型组小鼠胸腺内IκBαmRNA和蛋白表达水平较低，p-IκBα 蛋白表达水平较高，而远志皂苷B尤其是高剂量组IκBαmRNA和蛋白表达水平升高，p-IκBα 蛋白表达水平降低，说明远志皂苷B尤其是高剂量能抑制IκBα的磷酸化，从而抑制NF-κB的激活，这可能是其抑制电离辐射后淋巴细胞凋亡的机制。

激活的NF-κB会上调许多促凋亡靶基因，其中p53是NF-κB介导淋巴细胞凋亡的靶基因之一，p53的活化会加重淋巴细胞凋亡。本实验结果显示，模型组小鼠胸腺内p53mRNA和蛋白表达增高，远志皂苷B则能明显抑制p53mRNA和蛋白的表达。细胞凋亡还受到caspases的调控，细胞凋亡最终都是通过激活caspases而实现的。caspase-3是caspases家族中最关键的凋亡执行蛋白酶[26]。本实验发现，远志皂苷B能明显降低电离辐射损伤后胸腺中caspase-3的表达。

综上所述，远志皂苷B可通过抑制胸腺组织中NF-κB的激活抑制电离辐射损伤后胸腺中淋巴细胞凋亡的发生，对电离辐射损伤小鼠产生免疫保护作用。