盐酸曲美他嗪原料药中有关物质测定方法的研究

杨西邈，孙国祥，产运霞（1.沈阳药科大学药学院，沈阳 110016；.北京福元医药股份有限公司，北京 101104）

曲美他嗪（trimetazidine），化学名为1-（2，3，4-三甲氧基苄基）哌嗪，结构式见图1，是近年来发现的抗心肌缺血药物，可优化心肌细胞的能量代谢，改善患者心功能，同时能抑制氧自由基，使缺血心肌细胞维持正常活动，在心力衰竭患者的治疗中发挥着重要作用。本文根据合成工艺和降解机制，选择9种主要的有关物质A、B、C、D、E、F、H、J、K（结构见图1），建立盐酸曲美他嗪有关物质的测定方法，并采用一线多评法对方法进行验证和评估。为盐酸曲美他嗪原料药的质量控制提供依据。

图1 曲美他嗪及有关物质的化学结构式Fig 1 Chemical structures of trimetazidine and its related substances

1 材料

1.1 仪器与试药

高效液相色谱仪（型号：LC-2010CHT及LC-20AT，日本岛津公司）；电子分析天平（型号：MS105DU及ML204，梅特勒-托利多仪器有限公司）；pH酸度计（型号：FE20，梅特勒-托利多仪器有限公司）；电热鼓风干燥箱（型号：DHG101-1A，郑州长城科工贸易有限公司）；药品光照试验箱（型号：SHH-300GD-2，重庆市永生试验仪器厂）。

甲醇（色谱纯，Burdick & Jackson）；庚烷磺酸钠（色谱纯，Fisher Chemical）；氢氧化钠（分析纯，北京市光复科技发展有限公司）；磷酸、盐酸、30%过氧化氢（分析纯，北京化工厂）；盐酸曲美他嗪对照品（批号：100889-201302，质量分数99.9%，中国食品药品检定研究院）；有关物质A（批号：35069，质量分数94.9%）、B（批号：35343，质量分数99.7%）、C（批号：45715，质量分数99.9%）、D（批号：41708，质量分数99.0%）、E（批号：23180，质量分数99.9%）、F（批号：27212，质量分数99.2%）、H（批号：25681，质量分数 98.2%）对照品（LGC），有关物质J（批号：QM-6A01，质量分数 96.7%）、K对照品（批号：QM-6A03，质量分数99.6%）（北京福元医药股份有限公司）。盐酸曲美他嗪原 料 药（批 号：QM0171101、QM0171102和QM0171104，北京福元医药股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 稀释溶液 以体积分数为40%的甲醇水溶液为稀释溶液。取稀释溶液作为空白对照溶液。

2.1.2 对照品溶液 取盐酸曲美他嗪对照品约10 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，用稀释溶液溶解并稀释至刻度；精密量取1 mL置100 mL量瓶中，加稀释溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 杂质对照品定位溶液 分别精密称取杂质A～F、H、J和K对照品适量，用稀释溶液溶解并稀释制成质量浓度均为400 mg·L的溶液，即得。

2.1.4 杂质混合溶液 精密量取上述各杂质对照品定位溶液5 mL置同一250 mL量瓶中，用稀释溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.5 系统适用性溶液 取盐酸曲美他嗪对照品约40 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，用适量稀释溶液溶解，加入杂质混合溶液5 mL，用稀释溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.6 原料药供试品溶液 取盐酸曲美他嗪原料药约40 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，用稀释溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2 色谱条件[11-12]

色谱柱为Phenomenex Gemini C柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；以0.287%庚烷磺酸钠溶液（用10%磷酸调节pH值至3.2）-甲醇（体积比为643∶357）为流动相A，甲醇为流动相B，梯度洗脱（0～50 min，95%～75%A；50～52 min，75%～95%A；52～60 min，95%A）；流速为1.2 mL·min；检测波长为240 nm；柱温为30℃；进样量为10 μL。

2.3 方法学考察

分别取“2.1”项下空白对照溶液和系统适用性溶液进样测定，记录色谱图。曲美他嗪峰与相邻杂质峰的分离度大于1.5，色谱图见图2。

图2 空白对照溶液（A）和系统适用性溶液色谱图（B）Fig 2 Chromatograms of blank control solution（A）and system suitability（B）

2.4 专属性试验

2.4.1 酸破坏试验 取盐酸曲美他嗪原料药约200 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加1 mol·L盐酸溶液5 mL，室温放置24 h，加1 mol·L氢氧化钠溶液5 mL中和，用稀释溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4.2 碱破坏试验 取盐酸曲美他嗪原料药约200 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加1 mol·L氢氧化钠溶液5 mL，室温放置24 h，加1 mol·L盐酸溶液5 mL中和，用稀释溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4.3 氧化破坏试验 取盐酸曲美他嗪原料药约200 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加30%过氧化氢溶液5 mL，60℃放置1 h，取出，放冷，用稀释溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4.4 高温破坏试验 取盐酸曲美他嗪原料药适量，置量瓶中，在105℃放置6 h，取出，放冷，精密称取200 mg置50 mL量瓶中，用稀释溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4.5 光照破坏试验 取盐酸曲美他嗪原料药适量，置透明量瓶中，在5000 lx条件放置5 d，取出，放冷，精密称取200 mg置50 mL量瓶中，用稀释溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

上述处理方法均平行配制空白对照溶液。将破坏后的样品溶液和空白对照溶液分别进样测定，色谱图见图3。盐酸曲美他嗪在酸、碱、高温和光照条件下稳定性均良好，仅在氧化破坏条件下发生降解，所产生的降解产物在选定的色谱条件下与主峰达到良好的分离，空白无干扰，说明该方法专属性良好。

图3 专属性试验降解产物HPLC色谱图Fig 3 HPLC of destruction products of specificity test

2.5 线性关系考察

分别精密量取“2.1.4”项下杂质混合溶液1、2、4、5、8、10、16 mL，置20 mL 量瓶中，用稀释溶液稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度约为0.4、0.8、1.6、2.0、3.2、4.0和6.4 mg·L的对照品溶液。将上述对照品溶液与“2.1.4”项下的杂质混合溶液进样测定，记录色谱图。以各成分质量浓度（

C

，mg·L）为横坐标，峰面积（

A

）为纵坐标，用加权最小二乘法进行线性回归运算，得回归方程、相关系数及线性范围见表1；采用一线多评法进行评估，结果见表2，可靠度

R

均大于96.2%，表明有关物质A～F、H、J和K在质量浓度0.4～8 mg·L与峰面积呈良好线性关系。

表1 有关物质的回归方程、相关系数和线性范围结果
Tab 1 Regression equation，correlation coefficient and linear range of related substances

化合物 回归方程 相关系数r 线性范围/（mg·L－1）曲美他嗪 A＝7.719×103C－322.4 0.9999 0.408～8.160杂质A A＝7.531×103C－200.5 1.0000 0.381～7.615杂质B A＝1.235×104C－574.2 1.0000 0.469～9.386杂质C A＝2.437×104C－699.4 1.0000 0.418～8.360杂质D A＝4.973×103C＋100.5 1.0000 0.511～10.214杂质E A＝1.086×104C－642.0 0.9999 0.397～7.944杂质F A＝1.015×104C－6 09.4 0.9998 0.398～7.968杂质H A＝9.793×103C－57.9 1.0000 0.451～9.022杂质K A＝1.172×104C＋94.5 1.0000 0.457～9.137杂质I A＝1.006×104C－334.0 1.0000 0.451～9.017

表2 有关物质一线多评法各项参数值
Tab 2 Related substances by multi-markers assay by monolinear method

化合物 C0 bai＝a/C0 fi fsi RE（b）/% 1%bi f ''si 可靠度R（i）/%曲美他嗪 4.2840 75.2568 7794.26 1.0000 0.98 77.19 1.0000 －杂质A 3.9980 50.1251 7581.13 1.0281 0.67 75.31 1.0250 96.45杂质B 4.9275 116.5297 12 462.53 0.6254 0.95 123.46 0.6252 96.39杂质C 4.3890 159.3529 24 532.35 0.3177 0.66 243.73 0.3167 96.45杂质D 5.3625 18.7413 4991.74 1.5614 0.38 49.73 1.5522 96.50杂质E 4.1705 153.9384 11 017.94 0.7074 1.44 108.64 0.7105 96.24杂质F 4.1830 145.6610 10 298.66 0.7568 1.46 101.53 0.7603 96.23杂质H 4.7365 12.2327 9805.23 0.7949 0.13 97.93 0.7882 96.51杂质K 4.7970 19.6998 11 739.70 0.6639 0.17 117.20 0.6586 96.51杂质J 4.7340 70.5534 10 132.55 0.7692 0.71 100.62 0.7671 96.45

2.6 重复性试验

精密称定同一批盐酸曲美他嗪原料药6份，每份约40 mg，按“2.1.6”项下方法制备供试品溶液，进样测定，按外标法和一线多评法分别计算有关物质的含量，结果见表3，两种方法计算结果差异小，结果表明方法重复性良好。

表3 有关物质重复性试验结果
Tab 3 Repeatability of related substances with different methods

序号 化合物峰面积 一线多评法/% 外标法/%杂质A 杂质B 未知杂质 杂质A 杂质B 未知杂质 杂质A 杂质B 未知杂质1 2441 9725 1071 0.008 0.022 0.003 0.009 0.024 0.003 2 2802 9120 1112 0.010 0.020 0.004 0.010 0.022 0.004 3 2641 9463 1078 0.009 0.021 0.004 0.010 0.023 0.004 4 2459 9385 1142 0.009 0.021 0.004 0.009 0.023 0.004 5 2519 9757 1002 0.009 0.022 0.003 0.009 0.024 0.003 6 2223 8875 1155 0.008 0.020 0.004 0.008 0.022 0.004平均值 2514 9388 1093 0.009 0.021 0.004 0.009 0.023 0.004 RSD/%7.83.75.1－－－－－－

2.7 回收试验

取盐酸曲美他嗪原料药9份，每份约80 mg，精密称定，平均分成3组，分别置于20 mL量瓶中，每组分别加入杂质混合溶液5、10和15 mL，用稀释溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成相当于有关物质限度质量浓度50%、100%和150%的溶液，进样测定，按加校正因子的主成分外标法和一线多评法计算回收率，结果见表4。

表4 有关物质回收试验计算结果 (%)
Tab 4 Recovery of related substances with different methods (%)

化合物 一线多评法 外标法低中高 均值 RSD 低 中 高 均值 RSD杂质A 102.0 101.6 100.4 101.3 1.1 102.5 102.1 100.9 101.8 1.1杂质B 101.0 99.6 99.7 100.1 0.81 99.6 98.2 98.3 98.7 0.81杂质C 97.1 97.4 97.8 97.4 0.96 98.7 99.1 99.5 99.1 0.96杂质D 101.2 99.7 99.8 100.2 0.96 99.8 98.3 98.4 98.8 0.96杂质E 105.1 102.6 105.0 104.2 1.3 100.9 98.6 100.8 100.1 1.3杂质F 103.7 98.6 100.2 100.8 2.6 101.9 97.1 98.6 99.2 2.6杂质H 102.9 103.4 103.2 103.1 0.65 98.6 99.0 98.8 98.8 0.65杂质J 105.9 104.9 106.2 105.6 2.0 98.9 98.0 99.2 98.7 2.0杂质K 98.0 97.9 97.2 97.7 1.2 102.5 102.1 100.9 101.8 1.2

2.8 稳定性试验

取盐酸曲美他嗪对照品约10 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，用稀释溶液溶解并稀释至刻度；精密量取1 mL置100 mL量瓶中，用适量稀释溶液溶解，加入杂质混合溶液50 mL，用稀释溶液稀释至刻度，摇匀，即得对照品混合溶液。将此溶液在室温下放置，分别于0、3、8、12、16、20 和24 h，分别按“2.2”项下色谱条件进样分析，记录有关物质A、B、C、D、E、F、H、J、K及曲美他嗪的色谱峰面积，计算

RSD

分别为1.5%、1.1%、1.0%、0.50%、0.60%、0.40%、1.1%、1.1%、1.3%和0.6%，表明对照品混合溶液在24 h内稳定性良好。

取盐酸曲美他嗪原料供试品溶液，在室温下放置，分别于0、3、8、12、16、20 和24 h，分别按“2.2”项下色谱条件进样分析，样品中均未检出杂质峰，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.9 样品测定

取盐酸曲美他嗪对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度使曲美他嗪的色谱峰高约为满量程的20%，再取盐酸曲美他嗪供试品溶液，进样测定，3批样品均未检测到有关物质。

3 讨论

试验过程中发现，盐酸曲美他嗪及各杂质峰的保留时间容易随室温的变化而发生漂移，在试验进行中应尽量控制实验室的温度，并使用柱温控制效果较好的高效液相色谱仪进行分析。用加校正因子的主成分外标法和一线多评法分别计算重复性和回收率结果，结果表明两种方法测定的有关物质基本一致。为节省对照品用量，并减少标准曲线配制过程，同时使计算结果更加准确可靠，可采用一线多评法作为盐酸曲美他嗪有关物质的计算方法。