基于染色法和HPLC法测定龙葵不同部位中多酚含量

孟莹，王晓红，刘晓利，张琪，卢甜甜，程忠哲*（.潍坊医学院 药学院，山东 潍坊 6053；.淄博市疾病预防控制中心，山东 淄博 55000）

龙葵为茄科茄属植物龙葵（

Solanum nigrum

L.）的全草部分，是一种药食两用的植物，作为传统的中药材，常用于治疗疔疮、痈肿、丹毒、跌打扭伤等疾病。天然药物化学研究表明从龙葵中分离鉴定出的化学成分有生物碱、酚酸、黄酮等。其中酚酸类具有抑菌、抗病毒、抗氧化、降血压等作用；黄酮类具有抗炎、抗病毒、抗自由基、抗脂质过氧化、拮抗血小板活化因子、血管舒张、抗急性胰腺炎等作用。研究表明，绿原酸具有抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等活性。咖啡酸具有抗炎、抗氧化等活性。没食子酸可以抗糖尿病、抗肝纤维化、抗肿瘤等。（

E

）-阿魏酸能够降血脂、抗血栓、抗氧化。原儿茶酸可以发挥调节肝糖异生、抗炎、抗病毒等作用。芦丁具有抗病毒、抗自由基等活性。目前龙葵中各成分的定量研究多集中于生物碱和皂苷类化合物，针对其酚酸成分的含量研究尚未见报道，采用染色法测定龙葵中总酚酸及HPLC 法同时定量龙葵全草各部位（熟果、青果、茎、叶）中多种酚酸类化合物和黄酮类化合物的相关文献均未见报道。故本实验首先采用三氯化铁-铁氰化钾染色法研究龙葵不同部位（熟果、青果、茎、叶）中总酚酸含量的分布。然后，采用HPLC 分段波长法同时定量龙葵不同部位潜在的5 种酚酸类指标成分[绿原酸、咖啡酸、没食子酸、（

E

）-阿魏酸、原儿茶酸]及1 种黄酮类（芦丁）成分，为龙葵的质量控制及进一步开发提供参考。

1 仪器与试药

LC-20A 高效液相色谱仪，配有紫外检测器（SPD-20A）、UV-2700 紫外分光光度计（日本岛津公司），KQ3200DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），AR153CN 电子天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司]，200T 多功能粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司）。芦丁对照品（批号：100080-200707，纯度：90.5%，中国食品药品检定研究院），没食子酸（批号：C12211832）、（

E

）-阿魏酸（批号：C12085953）对照品（纯度≥99%，上海麦克林生化科技有限公司），绿原酸对照品（批号：PS000627，纯度＞98.0%，成都普思生物科技股份有限公司），原儿茶酸对照品（批号：W09A11B111046，纯度≥97%，上海源叶生物科技有限公司），咖啡酸对照品（批号：BQZ406，纯度：99.65%，上海毕得医药科技股份有限公司），十二烷基硫酸钠、铁氰化钾（上海麦克林生化科技有限公司），无水三氯化铁（国药集团化学试剂有限公司），浓盐酸（烟台远东精细化工有限公司），水为娃哈哈纯净水，色谱甲醇（MeOH）、色谱乙腈（ACN）（Sigma-Aldrich），其他试剂均为分析纯。龙葵全草，2020年9月采于山西省运城市垣曲县，经潍坊医学院药学院王晓红（讲师）鉴定为茄科属植物龙葵

Solanum nigrum

L.的全草。

2 三氯化铁-铁氰化钾染色法定量分析

2.1 溶液的配制

2.1.1 显色剂 ① 0.3%十二烷基硫酸钠（SDS）：精密称取SDS 0.300 g，加水100 mL 溶解，制得0.3%SDS 溶液。② 0.1 mol·L盐酸：精密量取浓盐酸4.1 mL，加超纯水至500 mL，制得0.1 mol·L的稀盐酸溶液。③ 0.9% K[Fe（CN）]试液：精密称取K[Fe（CN）]粉末0.450 g，加超纯水至50 mL，得0.9%K[Fe（CN）]溶液。④ 0.6% FeCl试液：精密称取FeCl固体0.300 g，加超纯水至50 mL，制得0.6%FeCl溶液。

2.1.2 供试品溶液 称取过五号筛的样品粉末0.1 g，加入2 mL 50%甲醇水溶液，称重，超声20 min，补足失重，12 000 r·min离心10 min，取出上清液，待用。

2.1.3 没食子酸对照品溶液 精密称定没食子酸对照品5 mg 于25 mL 量瓶中，用甲醇定容，配制成质量浓度为200 μg·mL的对照品储备液，再稀释10 倍得工作溶液，4℃保存，待用。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系考察 分别精密量取“2.1.3”项下没食子酸对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2 mL 于25 mL 量瓶中，加入2 mL 0.3% SDS溶液， 再加入1 mL 0.9% K[Fe（CN）]与0.6%FeCl的等比混合溶液，摇匀，暗处静置5 min 后以0.1 mol·L盐酸定容。暗处静置20 min，在400 ～800 nm 内进行光谱扫描，结果显示没食子酸在720 nm 波长处吸光度值最大，结果如图1 所示。以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标作线性回归，得到

y

＝0.5749

x

＋0.1151，

r

＝0.9985，线性范围0.16 ～1.6 μg·mL。

图1 没食子酸显色后紫外-可见吸收光谱Fig 1 UV-vis absorption spectra of gallic acid after the coloration

2.2.2 精密度试验 将0.6 mL 含有20 μg·mL没食子酸的对照品溶液显色后连续测定6 次，计算得含量

RSD

为0.24%，表明本法精密度良好。2.2.3 稳定性试验 提取液置于室温下分别于0、1、2、4、6、8、12、24 h 后显色处理，测定吸光度值，计算含量

RSD

为4.0%。表明供试品溶液室温条件下24 h 内稳定性良好。2.2.4 重复性试验 分别吸取6 份100 μL 供试品溶液于25 mL 量瓶中，显色，测定吸光度值，计算6 份供试品溶液含量的

RSD

为4.1%，表明重复性良好。2.2.5 加样回收试验 分别吸取100 μL 供试品液6份，按1∶1水平精密加入没食子酸对照品溶液适量，显色，测定吸光度值，计算加样回收率，结果总酚酸的平均加样回收率为103.70%，

RSD

为2.7%。

2.3 样品含量测定

按“2.1.2”项下方法配制龙葵不同部位供试品溶液，精密吸取100 μL 于25 mL 量瓶中，显色，测定吸光度值，计算不同部位总酚酸含量。熟果、叶、青果、茎中总酚酸含量依次为（7040±195）μg·g、（4430±120）μg·g、（2720±97）μg·g、（810±9）μg·g，占比分别为0.70%、0.44%、0.27%、0.008%。

3 HPLC 定量分析

3.1 色谱条件

Kromasil 100-5C（150 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相分别为0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）；梯度洗脱（0.01 ～11 min，5%B；11 ～20 min，5%→20%B；20 ～30 min，20%→30%B；30 ～40 min，30%→45%B；40 ～45 min，45%→70%B；45 ～48 min，70%→90%B；48 ～53 min，90%→90%B；53 ～53.1 min，90%→5%B；53.1 ～58.1 min，5%→5%B）；流速1 mL·min；柱温30℃；进样量20 μL；检测波长274 nm（没食子酸）、258 nm（原儿茶酸）、320 nm[绿原酸、咖啡酸、（

E

）-阿魏酸、芦丁]。

3.2 溶液配制

3.2.1 供试品溶液 称取过五号筛的样品粉末0.1 g，加入2 mL 50%甲醇溶液，称重，超声20 min，补足失重，12 000 r·min离心10 min，取上清液，旋蒸至干，加入50%甲醇溶液500 μL涡旋复溶，过0.22 μm 滤膜备用。

3.2.2 混合对照品溶液 精密称定对照品没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、（

E

）-阿魏酸和芦丁适量，加50%甲醇溶液溶解，配制成质量浓度分别为25、100、300、15、30 和250 μg·mL的混合对照品溶液，4℃保存。

3.3 方法学考察

3.3.1 专属性试验 取“3.2.2”项下混合对照品溶液和由茎、叶、青果、熟果粉末按“3.2.1”项下方法配制的供试品溶液分别进样分析。没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、（

E

）-阿魏酸和芦丁的保留时间分别为7.00、15.49、25.19、27.00、35.39、40.83 min，各化合物分离度良好且无明显干扰，如图2 所示。

图2 对照品和供试品代表性HPLC 色谱图Fig 2 Typical HPLC chromatograms of reference and samples

3.3.2 线性关系考察 精密量取“3.2.2”项下混合对照品溶液适量，稀释为6 个质量浓度梯度的混合对照品工作溶液，进样测定，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回归，各组分在其线性范围内与峰面积线性关系良好。以信噪比

S/N

≥3 时的浓度为检测限（LOD），信噪比

S/N

≥10 时的浓度为定量限（LOQ），结果如表1所示。

表1 6 种成分线性关系
Tab 1 Linear relationships of 6 components

成分回归方程r线性范围/（ng·mL－1）LOD/（ng·mL－1） LOQ/（ng·mL－1）没食子酸y ＝74.733x ＋7200.20.99932.5×102 ～2.5×104 48160原儿茶酸y ＝85.665x－150860.99981.0×103 ～1.0×105156520绿原酸y ＝66.128x ＋328140.99983.0×103 ～3.0×105 25 50咖啡酸y ＝123.94x－3584.90.99971.5×102 ～1.5×104 9 30（E）-阿魏酸y ＝116.95x ＋502280.99953.0×102 ～3.0×104 6 20芦丁y ＝31.641x－250300.99982.5×103 ～2.5×105 85170

3.3.3 精密度试验 将“3.2.2”项下的混合对照品溶液稀释1 倍，连续进样6 次，分别测得没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、（

E

）-阿魏酸、芦丁含量的

RSD

分别为2.1%、1.8%、1.9%、2.0%、1.8%、2.0%，表明仪器精密度良好，将上述溶液连续3 d 进样，测得这6 种成分含量

RSD

分别为1.7%、2.1%、1.8%、2.8%、2.3%、2.7%，表明仪器日间精密度良好。3.3.4 稳定性试 按“3.2.1”项下方法配制龙葵全草供试品溶液，置室温下分别于0、1、2、4、8、12、24 h 后进样分析，测得没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、（

E

）-阿魏酸、芦丁含量

RSD

分别为4.9%、3.9%、4.1%、4.8%、5.1%、2.2%。表明供试品溶液室温条件下24 h 稳定性良好。3.3.5 重复性试验 取按“3.2.1”项下方法平行配制的6 份龙葵全草供试品溶液进样分析，测得没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、（

E

）-阿魏酸、芦丁含量

RSD

分别为3.0%、3.2%、1.7%、0.80%、3.5%、2.3%，说明本法重复性良好。3.3.6 加样回收试验 称取龙葵熟果0.05 g，平行3 份，按“3.2.1”项下方法制备供试品溶液，分别按照50%、100%、150%水平精密加入混合对照品溶液，进样测定，计算加样回收率，结果6 种成分的平均加样回收率均在95.58%～108.41%，

RSD

在0.34%～4.5%。

3.4 样品含量测定

按“3.2.1”项下方法配制不同部位供试品溶液，进样分析，结果见表2，含量热图如图3 所示。

图3 成分含量热图Fig 3 Heatmap of component content

表2 龙葵各部位中各组分含量测定结果(μg·g， ＝3)
Tab 2 Content of 6 components in L.(μg·g， ＝3)

部位没食子酸原儿茶酸绿原酸咖啡酸（E）-阿魏酸芦丁青果熟果9.39±0.59 14.67±0.83 9.04±0.26 11.27±0.19 123.25±0.84 890.27±9.20 25.47±0.27 159.35±1.60茎3.54±0.19 3.60±0.02 6.50±0.07 30.75±0.27 18.00±0.28叶7.26±0.58 17.59±0.42 8.72±0.75 21.13±0.24 364.95±3.36 42.17±0.42 1.56±0.08 9.65±0.30 27.65±0.24 19.15±0.38 56.65±0.97

3.5 样品数据统计分析

样品中5 种酚酸成分含量的差异采用方差分析进行研究。由于茎中5 种酚酸类成分含量无较大差异，因此选择熟果、叶和青果中5 种酚酸类成分含量采用IBM SPSS Statistics 24.0 软件进行无重复数据的两因素方差分析，结果如表3 所示，表3 中成分的显著性

P

＝0.044 证明了在置信区间95%范围内熟果、叶和青果各部位酚酸的含量差异具有统计学意义（

P

＜0.05）。

表3 方差分析结果
Tab 3 Analysis of variance

注：a. ＝0.708（调整后 ＝0.489）。
Note：[a. ＝0.708（adjusted ＝0.708）]

源Ⅲ类平方和 自由度均方F显著性修正模型548 447.248a6 91 407.875 3.234 0.064截距196 070.2341196 070.234 6.936 0.030部位 92 588.2542 46 294.127 1.638 0.253成分455 858.9934113 964.748 4.031 0.044误差226 149.5178 28 268.690总计970 666.99815修正后总计 774 596.76514

4 讨论

研究表明，龙葵中含有酚酸和黄酮等活性成分，但其含量研究尚未见报道。龙葵通常为全草入药，不同部位中酚酸类化合物的含量可能存在差异。

酚酸类化合物在抗氧化、抗肿瘤、抑菌、护肝、提高免疫力等方面表现出生物活性，因此多种药用植物采用酚酸类化合物作为质量控制指标。如《中国药典》（2020年版）中冬葵果以总酚酸作为质量控制指标。本实验对龙葵中总酚酸含量进行测定，结果表明龙葵不同部位均含有总酚酸。其中熟果的含量最高，其次为叶，青果，茎中最低。药典规定冬葵果总酚酸不低于0.15%，提示总酚酸可以作为龙葵质量控制的指标之一。

进一步采用HPLC 分段波长法同时定量研究龙葵不同部位6 个多酚含量。分段波长法在提高检测灵敏度的同时，又使分析物附近干扰峰减少，有利于提高分离度。本实验选取多酚类化合物中活性较高的绿原酸、咖啡酸、没食子酸、（

E

）-阿魏酸、原儿茶酸及芦丁进行含量研究。结果显示，6 种活性成分在不同部位中均有检出。所有部位中绿原酸含量最高，其次为咖啡酸、芦丁、（

E

）-阿魏酸、没食子酸，原儿茶酸最低。不同部位中6种成分总和熟果含量最高，其次为叶、青果，茎中最低（见图3 左上）。绿原酸在熟果中含量最高（0.089%），其次为叶（0.036%），青果（0.012%），茎中最低（0.002%），药典规定杜仲叶、忍冬藤绿原酸含量分别不低于0.08%、0.10%，提示绿原酸可以作为龙葵质量控制的指标之一；咖啡酸在熟果中含量最高（0.016%），其次为叶（0.004%），青果（0.003%），茎中最低（0.0004%），药典规定蒲公英咖啡酸含量分别不低于0.02%，熟果中含量接近，提示其可以作为龙葵质量控制的指标之一。绿原酸和咖啡酸在龙葵中含量与《中国药典》规定较高或相近，可以作为主要质量控制指标，其他4 个酚酸类成分[（

E

）-阿魏酸、没食子酸、原儿茶酸及芦丁]可以作为次要质量控制指标。本实验采用三氯化铁-铁氰化钾染色法测定了不同部位的总酚酸，结果各部位均含有总酚酸。其中熟果、叶和青果总酚酸含量高于《中国药典》对冬葵果总酚酸含量的规定。进一步采用HPLC分段波长法同时定量龙葵不同部位中5 种酚酸类化合物和1 种黄酮类化合物的含量，发现绿原酸和咖啡酸与《中国药典》中的规定较高或接近，因此，绿原酸、咖啡酸可以作为龙葵潜在的主要质量控制指标。（

E

）-阿魏酸、没食子酸，原儿茶酸及芦丁可以作为龙葵潜在的次要质量控制指标。为龙葵的质量控制研究及进一步开发提供参考。