孟鲁司特钠片酸降解未知杂质结构及来源分析

张琳琳，刘阿利，张继环，王雪，张贵民（1.鲁南贝特制药有限公司，山东 临沂 276006；2.国家手性制药工程技术研究中心，山东 临沂 276006；3.山东省手性制药技术创新中心，山东 临沂 276006）

孟鲁司特钠（montelukast sodium），化学名1-[[[（

R

）-3-[（

E

）-2-（7-氯-2-喹啉基）乙烯基]-

α

-[2-（1-羟基-1-甲基乙基）苯乙基]苄基]硫基]甲基]环丙乙酸钠盐，是一种广泛应用的选择性白三烯受体拮抗剂。该药物具有高效、低毒、安全性好的优点，主要应用于成人和儿童哮喘的预防和长期治疗，能够缓解哮喘急性发作，减少激素用量，提高患者用药的依从性。孟鲁司特钠还可用于治疗儿童急性呼吸道感染后咳嗽，可以有效减轻咳嗽症状，降低炎症反应程度，具有较好的应用价值。近年来，由于口服有效、毒副作用小，孟鲁司特钠在临床上单独或与其他药物联合应用治疗多种呼吸系统疾病。

孟鲁司特钠最早由默克公司于1998年在美国申请上市，商品名SINGULAIR（顺尔宁），1999年在中国上市。目前国内有关孟鲁司特钠片降解产物的研究较少，主要对其中4种杂质进行了测定。在孟鲁司特钠一致性评价研究过程中发现，除文献中报道的特定杂质峰（杂质B，BP2020）外，其酸降解色谱图中又出现了2个未知杂质峰，此前并未有相关报道。随着人们对药物安全性的日益关注，药物中的杂质研究已成为药品质量控制的重要环节。因此，为保证用药安全，本文采用高效液相色谱串联质谱法（HPLCMS/MS）和高效液相色谱法（HPLC）对酸降解试验中产生的未知杂质进行初步的结构解析与来源分析，为后续相关质量控制研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters ACQ-2489高效液相色谱仪（美国Waters），高效液相色谱-质谱联用仪（高效液相色谱仪：Thermo-vanquish flex；质谱仪：Thermo-Q Exactive），XS105电子天平、S 210K pH计（梅特勒-托利多）。

1.2 试药

孟鲁司特钠片（批号：200401，自制），甲醇、乙腈 （色谱纯，英国莱德化学有限公司或默克公司；默克公司的甲醇和乙腈仅在未知杂质来源分析中使用，其他试验中均使用英国莱德化学有限公司的甲醇和乙腈），磷酸、醋酸铵、盐酸、氢氧化钠、磷酸氢二钾、冰醋酸（分析纯，国药集团），纯化水（自制）。

2 方法

2.1 HPLC条件

色谱柱：采用Waters XBridge phenyl柱（苯基键合硅胶为填充剂，4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流动相A：0.02 mol·L磷酸氢二钾溶液（用磷酸调节pH值至5.5），流动相B：甲醇-乙腈（1∶1），梯度洗脱（0～20 min，50%～30%A；20～25 min，30%A；25～30 min，30%～50%A；30～35 min，50%A）；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL·min；柱温：30℃；进样量：10 μL。

2.2 HPLC-MS/MS条件

2.2.1 色谱条件 采用Waters XBridge phenyl柱（苯基键合硅胶为填充剂，4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流动相：0.01 mol·L醋酸铵（用冰醋酸调节pH值至5.5）-乙腈（45∶55）；检测波长：254 nm；流速：0.3 mL·min；柱温：30℃；进样量：10 μL。

2.2.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）；正负离子模式；雾化电压：＋3.8 kV；鞘气流速：30 mL·min；辅助气流速：8 mL·min；毛细管温度：320℃；辅助气温度：310℃；扫描模式：Full mass-dd MS；扫描范围（

m/z

）：200～2000。

2.3 溶液配制

2.3.1 供试品溶液 避光操作，取本品粉末适量（约含主成分10 mg），精密称定，置10 mL量瓶内，加6 mL稀释剂[甲醇-水（9∶1）]超声使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，离心后取上清液滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3.2 酸降解样品溶液 避光操作，取本品粉末适量（约含主成分10 mg），精密称定，置10 mL量瓶内，加6 mL稀释剂超声溶解，再加入1 mL 1 mol·L的盐酸溶液，50℃加热5 min后，冷却，加入1 mol·L的氢氧化钠溶液中和，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，离心后取上清液滤过，取续滤液作为酸降解样品溶液。

3 结果与讨论

3.1 HPLC分析

取“2.3”项下供试品溶液和酸降解样品溶液分别注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下条件检测，色谱图见图1。未破坏的孟鲁司特钠样品色谱图（见图1A）中只有一个响应极高的主峰1，其保留时间为15.007 min，为孟鲁司特峰；酸降解后的孟鲁司特钠色谱图（见图1B）显示，除了主峰1外，还出现3个比较明显的色谱峰。其中峰4为已知孟鲁司特钠特定杂质峰（杂质B，BP2020）。在20.570 min、24.508 min处的杂质峰2以及杂质峰3为新出现的未知杂质峰，分别命名为杂质1、杂质2。

图1 孟鲁司特钠片高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of montelukast sodium tablets

3.2 未知杂质结构解析

3.2.1 未知杂质质谱信息 为分析2个未知杂质可能的结构及其生成路线，取“2.3”项下酸降解样品溶液，采用“2.2”项下HPLC-MS/MS条件获得未知杂质母离子（[M＋H]）与二级碎片离子信息，结果见表2及图2。

表2 孟鲁司特钠片酸降解未知杂质质谱结果
Tab 2 Mass spectra of unknown impurities from acid degradation of montelukast sodium tablets

杂质 保留时间/min 母离子[M＋H]＋/（m/z） 主要碎片离子/（m/z）杂质1 28.45 600.233 89 454.1935、422.1667、380.1204、292.0884、278.0731、131.0856杂质2 42.10 600.235 72 454.1439、422.1668、380.1211、292.0886、278.0732、131.0857

图2 孟鲁司特钠片酸降解未知杂质质谱图Fig 2 Mass spectra of unknown impurities in the montelukast sodium tablets under acid degradation

孟鲁司特钠片酸降解后出现的2个未知杂质分子量相同，均为599.2，较孟鲁司特（585.2）大14，与亚甲基（-CH-）分子量相当，初步推测两者可能为孟鲁司特在酸性条件下与溶剂甲醇的反应产物，可能的反应机制见图3；而且2个未知杂质的碎片峰离子丰度相当，分子峰及碎片峰峰形均相似，杂质峰的分子量与分子碎片分子量均高度吻合，初步判断两者为同一结构，色谱图中显示双峰可能为结构中的羧酸基团不完全解离所致，即2个未知杂质可能为同一结构的两种存在型式（酸型和解离型），两种型式之间存在解离平衡，见图4。

图3 未知杂质可能的反应机制Fig 3 Possible reaction mechanism of unknown impurity

图4 未知杂质之间可能存在的解离平衡Fig 4 Possible dissociation equilibrium between the unknown impurities

3.2.2 未知杂质质谱解析 假设未知杂质为孟鲁司特与甲醇在酸性条件下反应脱水生成，可能的结构如图3所示，对其进行质谱解析。因其在结构上与孟鲁司特相近，结合孟鲁司特的裂解规律，推断其可能的裂解途径如图5所示。由图中A线断裂后，失去A线右侧CHO基团后生成碎片

m/z

422.1，元素组成为CHClNOS，该碎片脱去CHOS基团后继续丢失两个氢生成碎片

m/z

278.1。由图中B线断裂后，失去CHOS基团后生成碎片

m/z

454.2，进而失去一分子甲醇得到碎片

m/z

422.2，元素组成为CHClN，一方面可能按照途径a进行碎裂，失去CH基团后生成碎片

m/z

292.1，元素组成为CHClN；另外可能按照途径b生成碎片

m/z

157.1，进一步丢失CH，生成碎片

m/z

131.1。从图中可以看出，未知杂质可能的裂解碎片分子量与质谱图中二级碎片分子量相当，具有较高的吻合度，因此推断2个未知杂质确为孟鲁司特与甲醇在酸性条件下的反应产物。

图5 未知杂质可能的裂解途径Fig 5 Possible fragmentation pathway of unknown impurities

3.2.3 未知杂质存在型式确认 由于2个未知杂质的分子量和质谱碎片高度吻合，推测两者可能为同一结构的两种存在形式，若推测成立，则在不同pH值的酸性条件下，两种形式存在解离平衡，通过调节流动相的pH值，2个未知杂质的比例可能会发生变化。因此通过试验进一步验证上述解析的合理性。

用磷酸调节流动相A的pH值分别为3.0、4.5、4.8、5.0、5.5、5.7、6.0、6.5、6.8，其余色谱条件均同“2.1”项下HPLC条件，取“2.3.1”项下酸降解样品溶液，依次进样，记录色谱图。通过调节流动相pH值，液相色谱图杂质1和杂质2峰的峰面积比例发生显著变化，见表3。

表3 不同pH值流动相条件未知杂质峰面积
Tab 3 Peak area of unknown impurity under different pH conditions of the mobile phase

流动相pH值峰面积杂质1 杂质2 杂质1∶杂质2 杂质1＋杂质2 3.0 2 211 181 0 100∶0 2 211 181 4.5 1 205 732 1 120 855 52∶48 2 336 587 4.8 1 217 034 1 169 259 51∶49 2 376 293 5.0 1 200 161 1 197 320 50∶50 2 397 481 5.5 1 195 602 1 217 187 50∶50 2 412 789 5.7 1 190 161 1 260 161 49∶51 2 450 322 6.0 1 160 855 1 295 732 47∶53 2 456 587 6.5 0 2 556 307 0∶100 2 556 307 6.8 0 2 568 923 0∶100 2 568 923

当流动相A的pH值在3.0时，色谱图中两个未知杂质中只有杂质1峰，说明2个未知杂质在低pH环境中只有未解离型式稳定存在；当流动相A的pH值在3.5～6.0时，色谱图中始终存在杂质1和杂质2，并随着pH值的升高，杂质2峰的峰面积相对增大，而杂质1峰的峰面积相对减小；当流动相A的pH值≥6.5时，色谱图中未知杂质峰完全转变成杂质2峰，说明未知杂质的羧酸根已完全解离，此时主要以解离型存在。在不同的pH值环境中，两个杂质比例不同，出峰时间也略有差异，因此，判断杂质1与杂质2之间存在解离平衡，在一定pH条件下可以相互转化，即杂质1与杂质2为同一分子结构的两种存在型式，杂质1以酸的型式存在，杂质2以解离的型式存在。

3.3 未知杂质来源分析

为进一步验证酸降解试验中产生的未知杂质为孟鲁司特在酸性条件下与溶剂甲醇反应所得，分别使用来自不同厂家的甲醇和乙腈配制甲醇-水（9∶1）、乙腈-水（9∶1）作为溶剂，按“2.3”项下制得酸降解样品溶液，同“2.1”项下HPLC条件进行检测，见图6。图6A1与图6A2中均存在4个明显的色谱峰，分别为主峰、杂质B峰和19.3 min、25.6 min的2个未知杂质峰，使用不同厂家的甲醇的酸降解色谱图无明显差异；而图6B1与图6B2中仅存在主峰和杂质B峰，在19.3 min和25.6 min的两个未知杂质峰均未出现，而且使用不同厂家的乙腈的酸降解色谱图也无明显差异。因此进一步确认未知杂质为孟鲁司特钠在酸性条件下与溶剂甲醇的反应产物。

图6 孟鲁司特钠片酸降解高效液相色谱图Fig 6 HPLC chromatogram of montelukast sodium tablets under the acid degradation

4 结论

本文采用HPLC-MS/MS法对孟鲁司特钠片酸降解试验中出现的未知杂质进行定性分析，推测其结构以及可能的反应机制；通过调节流动相的pH值进行液相分析，确定2个未知杂质为同一结构的两种存在型式（酸型和解离型）；进一步来源分析表明未知杂质为孟鲁司特钠在酸性条件下与溶剂甲醇的反应产物，并非孟鲁司特钠片自身的酸降解产物。本品在加速和长期试验考察过程中均未检出此未知杂质，说明此杂质不影响产品质量，且在制剂生产、储存、运输过程中不会接触到强酸和高温环境，因此在后续的质量控制研究中无需关注。

值得注意的是，现行USP43和BP2020收载的孟鲁司特钠片质量标准中有关物质检查项下，使用的溶剂为甲醇-水（3∶1），流动相为乙腈-甲醇（2∶3），都涉及甲醇。建议在试验中应注意避免高温及强酸环境，供试品溶液临用配制，以免引入其他杂质。