健脾消癌方的HPLC-Q-TOF/mF指纹图谱分析及多指标含量测定

王容容，柏正平，杨静，王其美，陈林，卢林竹，蒋益兰*（.湖南省中医药研究院附属医院，长沙 40006；2.湖南省中医药研究院中药研究所，长沙 400；.湖南中医药大学，长沙 40028）

健脾消癌方是湖南省名中医蒋益兰教授防治大肠癌的经验方。全方由人参、白术、枳实、蛇舌草、半枝莲、重楼、甘草等13味药物组成。方中人参为君，合白术、茯苓、甘草为四君子汤益气健脾，以健生化之源，而疗诸虚不足，从而达到扶正固本的目的；黄芪甘温，益气补虚健脾为臣；枳实、郁金行气除痞，白花蛇舌草、半枝莲、重楼、藤梨根清热解毒、消痈散结，法半夏燥湿化痰，薏苡仁健脾渗湿，以上共用之为佐；甘草调和诸药为使。全方药物配伍精要，攻补兼施，共奏益气健脾、化瘀解毒之功，顺应了大肠癌患者“虚、瘀、毒”并存的病机特点。全方扶正祛邪，标本同治，在大肠癌和大肠癌术后巩固治疗中取得满意的临床疗效。临床研究表明，本方能降低大肠癌患者术后复发转移率，提高生存质量，延长生存期。动物实验研究结果表明，健脾消癌方能有效延长大肠癌裸鼠生存期，降低裸鼠肝转移率，降低肝组织血管内皮生长因子（VEGF）和血管内皮生长因子受体（VEGFR-2）蛋白表达；可通过调节基质金属蛋白酶（MMP）-9、基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）、VEGF等因子影响血管生成；可通过调控TGF-

β

非Smad信号通路PTEN-PI3K/AKt信号通路抑制肿瘤血管形成，从而降低结肠癌裸鼠模型转移率，提高裸鼠体质量，抑制瘤体生长等；并可通过逆转转化生长因子-

β

（TGF-

β

）诱导的上皮-间质转化（EMT）过程防治大肠癌转移。中药复方由多味药物配伍而成，其有效成分多，具有多成分、多靶点、多途径的作用特点。对中药复方中多成分及其含量进行分析鉴定是中药复方现代化质量控制的重要手段和趋势。鉴于健脾消癌方防治大肠癌疗效确切，有必要对其进行全面的质量控制研究。本实验拟对健脾消癌方的指纹图谱和多组分含量测定进行研究，以全面控制该复方的质量，通过建立健脾消癌方的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，并进一步采用高效液相色谱串联飞行时间质谱对其主要化学成分进行结构鉴定，对其指标成分进行定量分析，以期为健脾消癌方制剂的研发和质量控制奠定基础。

1 材料

1290高效液相串联四极杆飞行时间质谱6530、Agilent 1200高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），XPE105型析天平（精度：0.01 mg）、AL204型万分之一电子天平、XPE105型十万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），HH电热恒温水浴锅（江苏中大仪器科技有限公司），101-2AB电热恒温鼓风干燥箱（北京中兴伟业仪器有限公司），SJIA-10N-50A冷冻干燥机（宁波双嘉化器有限公司），KM-500DB型超声波清洗器（昆山美美超声仪器有限公司）。对照品野黄芩苷（批号：110842-200403，纯度：96.8%）、甘草酸铵（批号：110731-201720，纯度：97.6%）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号：110920-201606，纯度：95.4%）、新橙皮苷（批号：11857-201703，纯度：97.6%）、柚皮苷（批号：110772-202116，纯度：98.5%）、腺苷（批号：110879-200202，纯度：98.9%）（中国食品药品检定研究院），芸香柚皮苷（成都克洛玛生物科技有限公司，批号：CHB180917，纯度：98.1%），甲醇为色谱纯（安徽天地高纯溶剂有限公司），纯水（华润怡宝饮料有限公司），甲酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）。

人参（

Panax ginseng

C.A.Meyer），白术（

Atractylodes Macrocephala

Koidz.），茯 苓[

Poria cocos

（Schw.）Wolf]，甘 草（

Glycyrrhiza uralensis

Fisch），法 半 夏[

Pinellia ternata

（Thunb.）Breit]，黄 芪[

Astragalus membranaceus

（Fisch.）Bge.]，白花蛇舌草（

Hedyotis diffusa

Willd），半枝莲（

Scutellaria barbata

D.Don），枳实（

Citrus aurantium

L.），郁金（

Curcuma.wenyujin

Y.H.Chen et C.Ling），重楼[

Paris polyphylla Smith

var.

chinenisi

（Franch）Hara]，薏苡仁[

Coix lacryma-jobi

L.var.

mayuen

（Roman.）Stapf]，藤梨根（

Actinidia chinensis

Planchon），均由湖南省中医药研究院提供，经湖南省中医药研究院附属医院药剂科田其学主任药师鉴定均符合2020版《中国药典》要求。制备10批健脾消癌方冻干粉所用的各饮片均源自道地产地或主产区。

2 方法与结果

2.1 健脾消癌方冻干粉的制备

称取人参10 g，白术10 g，茯苓15 g，甘草6 g，法夏9 g，黄芪15 g，蛇舌草15 g，半枝莲16 g，枳实10 g，郁金10 g，重楼10 g，薏苡仁30 g，藤梨根15 g，按10倍生药量加水，煎煮1 h，保存药液，药渣再加入8倍量水，煎煮1 h，合并药液，浓缩成近2倍水量时，放置过夜，去沉淀，继续浓缩成1.5 g·mL备用。将其置于真空冷冻干燥机中，经预冷、抽真空、一次升华、冻干72 h，即得健脾消癌方冻干粉。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液制备 精密称量健脾消癌方冻干粉（样品S1）0.5 g于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，称重，超声处理30 min（功率400 W，频率40 kHz），放冷，称重，用50%甲醇补足减少的重量，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2.2 样品溶液制备 按照“2.1”项下冻干粉制备方法，分别制备人参、白术、茯苓、甘草、法夏、黄芪、蛇舌草、半枝莲、枳实、郁金、重楼、薏苡仁、藤梨根冻干粉。按“2.2.1”项下方法分别制备对应药材的样品溶液。

2.2.3 对照品溶液 取芸香柚皮苷、橙皮苷、野黄芩苷、新橙皮苷、柚皮苷、甘草酸铵对照品适量，精密称定，置于不同量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为1.09、1.02、1.01、1.03、1.02、1.02 mg·L的单一对照品储备液。

分别精密量取各对照品储备液适量，置于同一20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为0.05 mg·L的混合对照品溶液。

2.2.4 色谱条件 色谱柱为Welch UItimate AQC（5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相为甲醇（A）0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～26 min，5%A；26～45 min，5%～30%A；45～63 min，30%～40%A；63～78 min，40%～48%A；78～93 min，48%～70%A；93～108 min，70%～95%A；108～113 min，95%～100%A），进样量5 μL，柱温30℃，流速1 mL·min，检测波长254 nm。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度 取健脾消癌方冻干粉（样品S1）供试品溶液，连续测定6次，以4号峰（柚皮苷）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的

RSD

均≤10.0%，表明仪器精密度良好。2.3.2 重复性 取健脾消癌方冻干粉（样品S1）适量，按“2.2.1”项下方法平行制备供试品溶液6份，进样测定，以4号峰（柚皮苷）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的

RSD

均≤10.0%，表明该方法重复性良好。2.3.3 稳定性 取健脾消癌方冻干粉（样品S1）的供试品溶液适量，分别于制备后0、3、6、9、12、15、18、21、24 h进样测定，以4号峰（柚皮苷）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的

RSD

均≤10.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4 指纹图谱的建立

按“2.2.1”项下方法制备10批健脾消癌方冻干粉（样品S1～S10）的供试品溶液，进样测定，记录各样品色谱图，见图1。

图1 10批健脾消癌方的HPLC指纹图谱Fig 1 HPLC fingerprint of 10 batches of Jianpi Xiaoai decoction

2.4.1 参照峰的选定 在10批健脾消癌方冻干粉指纹图谱中，柚皮苷色谱峰保留时间适中、峰面积大且稳定、分离度好，故选用柚皮苷（峰4）为参照峰。

2.4.2 相似度评价及色谱峰归属 将10批健脾消癌方（样品S1～S10）的指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件（2004版）中，以样品S1色谱图为参照图谱，利用中位数法，设置时间窗宽度0.5 min，进行多点校正并生成对照指纹图谱（R），计算相似度。结果共标记了10个共有峰，10批样品的HPLC指纹图谱与对照指纹图谱的相似度分别为0.981、0.967、0.935、0.976、0.987、0.988、0.988、0.981、0.935、0.987、1.000，表明各批样品之间差异较小，制备工艺稳定，见表1。

表1 10批健脾消癌方特征谱图相似度
Tab 1 Similarity of characteristic spectrum of 10 batches of Jianpi Xiaoai decoction

S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 对照指纹图谱S1 1.000 0.945 0.877 0.978 0.964 0.969 0.968 1.000 0.877 0.964 0.981 S2 0.945 1.000 0.880 0.933 0.956 0.961 0.959 0.945 0.880 0.956 0.967 S3 0.877 0.880 1.000 0.884 0.890 0.889 0.887 0.877 1.000 0.890 0.935 S4 0.978 0.933 0.884 1.000 0.956 0.966 0.962 0.978 0.884 0.956 0.976 S5 0.964 0.956 0.890 0.956 1.000 0.987 0.990 0.964 0.890 1.000 0.987 S6 0.969 0.961 0.889 0.966 0.987 1.000 0.997 0.969 0.889 0.987 0.988 S7 0.968 0.959 0.887 0.962 0.990 0.997 1.000 0.968 0.887 0.990 0.988 S8 1.000 0.945 0.877 0.978 0.964 0.969 0.968 1.000 0.877 0.964 0.981 S9 0.877 0.880 1.000 0.884 0.890 0.889 0.887 0.877 1.000 0.890 0.935 S10 0.964 0.956 0.890 0.956 1.000 0.987 0.990 0.964 0.890 1.000 0.987对照指纹图谱 0.981 0.967 0.935 0.976 0.987 0.988 0.988 0.981 0.935 0.987 1.000

将样品S10的色谱图与各样品色谱图进行比较，确定峰1为白术、法夏、茯苓、甘草、黄芪、人参、蛇舌草、藤梨根、薏苡仁、重楼共有峰；峰2为半枝莲、枳实、蛇舌草共有峰；峰3归属于枳实；峰4归属于枳实；峰5归属于半枝莲；峰6归属于枳实；峰7归属于枳实；峰8归属于半枝莲；峰9为蛇舌草，重楼共有峰；峰10为法半夏，甘草共有峰。根据对照品信息指认了6个色谱峰，分别为3号峰（芸香柚皮苷），4号峰（柚皮苷），5号峰（橙皮苷），6号峰（野黄芩苷），7号峰（新橙皮苷），10号峰（甘草酸铵），见图2～3。

图2 混合对照品HPLC图Fig 2 HPLC chromatogram of mixed reference substance

2.5 健脾消癌方LC-MS分析

液相条件同“2.2.4”项下离子化方式：电喷雾离子化（ESI）；ESI源温度325℃；脱溶剂350℃；源电压4.0 kV；检测电压1.0 kV；碰撞电压130 V；雾化气（N）流速为8 L·min。通过正负模式质谱分析发现，复方在负离子模式下的质谱信息响应较好，见图4，根据其质谱信息和裂解规律，文献数据进行结构鉴定，共确定34个化学成分，结果见表2。

图4 健脾消癌方总离子流色谱图Fig 4 Total ion flow chromatogram of Jianpi Xiaoai decoction

表2 健脾消癌方的LC-MS分析结果
Tab 2 LC-MS of Jianpi Xiaoai decoction

峰号tR /min 离子模式 实测m/z 分子式 二级特征碎片 鉴定结果 来源1 6.750[M－H]－ 191.0198C6H8O7 111.0103，147.0320 柠檬酸 藤梨根2 7.660[M－H]－ 989.3359C34H18N6O3 179.0584，31.1136，503.1683，665.2233，827.2814未知3 8.267[M－H]－ 243.0622C9H12N2O6 200.0597，152.0383，130.9701，110.0285 尿苷 茯苓/法夏4 11.266[M－H]－ 389.1173C16H22O11 137.0619，209.0489，323.0327 未知5 11.300[M＋HCOO]－ 312.0989C10H13N5O4 266.1040，134.0614，117.0347 腺苷 法夏6 15.478[M－H]－ 282.0918C10H13N5O5150.0447 鸟苷 法夏7 16.961[M－H]－ 344.0516C16H11NO8 150.0465 未知8 31.485[M－H]－ 389.1212C17H18N4O7 101.0280，139.0439，147.0485，165.0620，183.0726，209.0526，227.0637未知10 44.357[M－H]－ 339.0845C13H16N4O5S177.0240 未知11 47.491[M－H]－ 515.1626C22H28O14 161.0278，469.1511 未知12 48.300[M＋HCOO]－ 531.1551C21H10O14 177.0243，485.1472 未知13 55.511[M－H]－ 593.1703C27H30O15 353.0781，473.1229 维采宁-2 半枝莲14 56.387[M－H]－ 163.0443C9H8O3 119.0532 4-香豆酸 藤梨根15 57.702[M－H]－ 649.2748C38H38N2O8 174.9612，242.9482，347.1954，443.2229，605.2839未知16 59.757[M－H]－ 595.1882C27H32O15 287.0660，151.0087 圣草次苷 枳实17 59.858[M－H]－ 741.2534C38H38N4O10151.0081，271.0717，339.0842，459.1479，621.1913未知18 61.038[M－H]－ 491.1320C29H20N2O6 268.0485，283.0715 未知19 61.341[M－H]－ 417.1367C21H22O9 255.0747，135.0131，119.0542 甘草苷 法夏/甘草20 62.790[M－H]－ 549.1805C26H30O13 417.1344，255.0745，135.0132 芹糖甘草苷 法夏21 63.295[M－H]－ 463.1236C21H20O12 287.0660，269.0553，243.0729，225.0649，193.0396，181.0185，167.0037，153.0241，139.0077红花素 7-O-葡糖苷酸 半枝莲22 64.070[M－H]－ 623.2229C29H36O15 461.1849，179.0396，161.0295 毛蕊花糖苷 半枝莲23 66.025[M－H]－ 579.1946C27H32O14 271.0719，151.0090 芸香柚皮苷 枳实24 68.114[M－H]－ 579.1911C27H32O14 271.0698，151.0078 柚皮苷 枳实25 69.294[M－H]－ 609.2005C28H34O15 301.0796 橙皮苷 枳实26 69.664[M－H]－ 623.2199C29H36O15 461，1813，315.1182，251.1182，179.0396，161.0290毛蕊花糖苷异构体 半枝莲27 70.102[M－H]－ 461.0789C21H18O12 285.0414，267.0313，239.0358，175.0239，166.9980，136.9869野黄芩苷 半枝莲28 71.383[M－H]－ 609.1992C28H34O15 301.0796 新橙皮苷 枳实29 83.413[M＋HCOO]－ 639.2017C27H30O15 593.2018，473.1536，285.0829 山柰酚-3-O-（6-O-α-L-鼠李糖基）-β-D-吡喃葡萄糖苷蛇舌草30 84.997[M－H]－ 461.0829C21H18O12 285.0463，257.0320，241.0554，213.0591，175.0296，145.0347异黄芩素 7-O-β-D-葡糖苷酸 半枝莲31 88.266[M－H]－ 1017.4450C41H14N8O25277.1021，607.2902，885.3972 未知32 90.018[M＋HCOO]－ 845.5108C42H72O14 799.5034，637.4463，475.3898，161.0481，119.0373人参皂苷Rg1 人参33 91.939[M－H]－ 1059.4508C44H16N6O27867.3827，927.4046，999.4292 未知34 102.486[M－H]－ 821.4104C42H62O16 351.0593，469.3353，627.3578，645.3691，759.4006甘草酸铵 甘草

2.6 多指标成分的含量测定

2.6.1 线性关系考察 精密吸取“2.2.3”项下各单一对照品储备液适量，分别稀释成一系列不同质量浓度的溶液，按“2.2.4”项下方法进样测定，记录色谱峰面积，以峰面积为纵坐标，对照品质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，当仪器信噪比（

S/N

）＝3时为检测限，

S/N

＝10时为定量限。结果见表3，6种成分在相应质量浓度范围内与峰面积呈良好线性关系。

表3 健脾消癌方中6种指标成分的线性关系考察
Tab 3 Linearity of 6 components in Jianpi Xiaoai decoction

成分 线性回归方程 R2 范围/（mg·mL－1） 检测限/（μg·mL－1） 定量限/（μg·mL－1）芸香柚皮苷 y＝2×106x＋1.66×104 0.9999 0.011～4.352 0.78 2.72柚皮苷 y＝2×106x＋3.72×104 0.9995 0.010～5.105 0.73 2.55橙皮苷 y＝1×106x＋1.61×104 0.9999 0.010～4.072 1.02 3.39新橙皮苷 y＝2×106x＋1.26×104 0.9998 0.010～4.120 0.74 2.58野黄芩苷 y＝4×106x－5.33×104 0.9999 0.010～4.024 0.50 1.68甘草酸铵 y＝4×106x＋2.46×104 0.9997 0.020～3.054 0.51 1.71

2.6.2 精密度试验 取混合对照品溶液，连续进样6次，结果芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、野黄芩苷、新橙皮苷、甘草酸铵峰面积的

RSD

分别为2.3%、0.67%、6.7%、0.70%、0.19%、4.2%，表明仪器精密度良好。

图3 健脾消癌方HPLC指纹图谱色谱图Fig 3 HPLC fingerprint chromatogram of Jianpi Xiaoai decoction

2.6.3 稳定性试验 取同一健脾消癌方冻干粉（样品S1）供试品溶液，分别于制备后0、3、6、9、12、15、18、21、24 h进样测定，结果芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、野黄芩苷、新橙皮苷、甘草酸铵峰面积的

RSD

分别为2.2%、1.3%、5.6%、0.80%、0.30%、3.9%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。2.6.4 重复性试验 取同一健脾消癌方冻干粉（样品S1）的供试品溶液6份，进样测定，记录色谱图，结果芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、野黄芩苷、新橙皮苷、甘草酸铵平均质量分数分别为1.59、12.97、2.94、1.33、6.96、0.93 mg·g，

RSD

分别为4.8%、8.9%、5.2%、5.0%、8.6%、3.7%，表明该方法重复性良好。2.6.5 加样回收试验 称取已知各指标成分含量的健脾消癌方冻干粉（样品S1）约0.125 g，精密称定，平行6份，分别按照样品中相对应成分含量1∶1加入各对照品溶液。制备供试品溶液后进行测定，结果芸香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、甘草酸铵、橙皮苷、野黄芩苷的平均加样回收率分 别 为101.58%、102.94%、103.48%、100.05%、99.32%、100.08%，

RSD

分别为2.2%、2.2%、3.0%、0.50%、5.3%、4.8%，表明该方法准确可靠。

2.6.6 样品测定 取10批健脾消癌方冻干粉（样品S1～S10），制备供试品溶液，进行测定，计算6个指标成分的含量。结果10批健脾消癌方冻干粉中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、野黄芩苷、新橙皮苷、甘草酸铵质量分数范围分别为1.80～2.55、12.90～17.86、3.49～5.28、1.26～1.82、6.93～9.47、1.05～1.51 mg·g，见表4。

表4 10批健脾消癌方中6个指标成分的含量(mg·g)
Tab 4 Content of 6 components in 10 batches of Jianpi Xiaoai decoction (mg·g)

序号 芸香柚皮苷 柚皮苷 橙皮苷 野黄芩苷新橙皮苷甘草酸铵S1 1.88 15.73 5.03 1.82 8.34 1.05 S2 2.33 17.86 5.28 1.64 9.05 1.43 S3 1.80 12.90 3.49 1.26 6.93 1.13 S4 2.20 16.83 4.61 1.65 9.04 1.51 S5 2.03 14.92 4.14 1.47 8.03 1.28 S6 2.42 17.47 4.85 1.70 9.47 1.46 S7 2.17 16.01 4.53 1.51 8.60 1.22 S8 2.55 16.99 4.79 1.64 9.19 1.28 S9 2.06 14.78 4.14 1.39 7.99 1.15 S10 2.31 16.95 4.60 1.60 9.15 1.29

3 讨论

本文首次建立了健脾消癌方中芸香柚皮苷、野黄芩苷等6种活性成分含量的HPLC-Q-TOFmF法，该方法分离度好、准确度高，对于控制健脾消癌方配伍前后化学成分性质和含量变化及作用具有重要意义。6种活性成分中，野黄芩苷来源于半枝莲，芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷来源于枳实，甘草苷来源于甘草/法夏。研究表明，野黄芩苷能够抑制结肠肿瘤干细胞的体外和体内分化，其作用机制在于下调hedgehog信号通路活性；野黄芩苷与顺氯氨铂（DDP）联用可提高肺癌A549/DDP细胞对DDP的敏感性，抑制克隆形成，其机制可能与下调c-met蛋白表达有关；熊果酸能抑制结肠癌细胞增殖及诱导结肠癌细胞凋亡；

β

-谷甾醇通过与大肠癌中的p53-MDM2相互作用，抑制多药耐药，还可以协同吉西他滨调节细胞凋亡和通过抑制Akt/GSK-3

β

信号转导抑制上皮-间质转化发挥抗胰腺癌活性；人参皂苷是人参发挥抗癌活性的主要成分，如人参皂苷Rh、人参皂苷-Rh-qt、人参皂苷-Rh-qt和人参二醇都具有诱导肿瘤细胞周期停滞，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长，抗肿瘤血管生成的作用，并在免疫浸润、慢性炎症损伤、肠道菌群、化疗耐药等研究中展示出良好的潜力；异甘草素可抑制骨肉瘤细胞的增殖、凋亡和迁移。当然，复方中药配伍后的化学成分并不是单味药物化学成分的简单相加，其提取过程中各化学成分也会产生变化，这可能是复方配伍的精髓，也是研究开发复方新药的有效依据。本课题组后续将尝试增加皂苷类、酚酸类及多糖类的指标成分，对健脾消癌方的有效成分和作用机制进一步研究，将名老中医经验方制备方式、方法标准化。经验方物质基础的研究对中药复方制剂的开发起着关键作用。本研究建立的10批健脾消癌方冻干粉HPLC指纹图谱相似度高、分离度好，对芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、野黄芩苷、新橙皮苷、甘草酸铵6种指标性成分进行定性和定量分析，较为全面地反映了该复方化学成分信息，可为该复方药效活性物质作用机制研究提供科学依据，为健脾消癌方复方制剂的研发提供参考。